試劑、試劑盒 TSES 緩沖液TSES 緩沖液飽和酚氯仿辛醇乙酸鉀乙醇緩沖液 Almol LNaH2P04 緩沖液氯胺 T 溶液Na125I5 mmol LNa2S2O5lOOmmol LKINET 緩沖液酵母 tRNA蔗糖纖維素柱平衡液三重蒸餾水0.1mol LNaOH5 mmol LEDTA0.1mol LNaCLTES 緩沖液3mol LNaAc甲酰胺
儀器、耗材 SephadexG-25 柱 寡聚脫氧胸苷 (digo-dT) 纖維素柱 多聚尿瞭陡核甘酸柱
實驗步驟
一材料與設備
1)TSES 緩沖液：0.2mol/LTris-HCl，0.05mol/LNaCl0.011mol/LEDTA,0.5%SDS
2)TSES 緩沖液飽和酚
3) 氯仿：辛醇 (24:1)
4) 乙酸鉀
5) 乙醇
6) 緩沖液 A:0.lmol/LTris-HCl(pH7.4)，50 mmol/LNaCl10 mmol/LEDTA，0.2%SDS
7)lmol/LNaH2P04 緩沖液，pH7.4
8) 氯胺 T 溶液：100ug 氯胺 T 溶于 25ul50 mmol/LNaH2P04
9)Na125I
10)5 mmol/LNa2S2O5
11)l00 mmol/LKI
12)SephadexG-25 柱
13)NET 緩沖液：10 mmol/LTris-HCl(pH7.4)，100 mmol/LNaCllOmmol/LEDTA
14) 酵母 tRNA
15) 蔗糖
16) 寡聚脫氧胸苷 (digo-dT) 纖維素柱
17) 纖維素柱平衡液：0.5mol/LNaCl，1 mmol/LEDTA,20 mmol/LTris-HCl(pH7.6)，0.1%SDS
18) 三重蒸餾水
19)0.1mol/LNaOH
20)5 mmol/LEDTA
21)0.1mol/LNaCL
22)TES 緩沖液：10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，lmmol/LEDTA，0.05%SDS
23)3mol/LNaAc
24) 多聚尿瞭陡核甘酸柱 (polyuridylic-acid-Sepharose4B)
25) 甲酰胺
二操作方法
1. 酚：氯仿：辛醇法全 RNA 提取與純化
1) 向純化的甲型肝炎病毒 (HAV) 內加入一定體積的 TSES 緩沖液。
2) 振蕩 30s 至 1 min，置冰浴中 15 min。
3) 加入 1/2 體積的 TSES 緩沖液飽和酚，再加 1/2 體積的氯仿：辛醇, 將混合液振搖 5?lOmin
4) 在 4°C 下，2500r/min 離心 20 min。
5) 吸出水相，再加入 1/2 體積的 TSHS 緩沖液飽和酚及 1/2 體積氯仿：辛醇，按上述步驟反復抽提 4 次。其水相為全核酸。
6) 全核酸內加入 2% 乙酸鉀及 2 倍體積的冷乙醇，-20℃ 放置 2 h 后，用細玻璃棒或長注射針頭輕輕攪動，去除絮狀物 (DNA)
7) 在 4°C 下，4000r/min 商心 20 min。
8) 棄去上清液，將沉淀再次溶于原體積的緩沖液 A
9) 加蛋白酶 K 至終濃度為 200ug/ml，37℃ 孵育 1?2 h
10) 再 TSES 飽和酚：氯仿：辛醇抽提一次。在 4℃ 下 4000r/mim 離心 20 min
11) 沉淀復溶于原體積緩沖液 A, 再加入 2.5 倍體積的冷乙醇，一 20℃ 放置 2 h
12)10000r/min 離心 30 min，沉淀為全 RNA。
2. 氯胺 T-蔗糖密度梯度起離心法純化全 RNA
1)TSES 飽和酚：氯仿：辛醇抽提 4 次可獲得 HAV 的全 RNA
2) 向全 RNA 提取物中加入 10ul1mol/LNaH2PO4 緩沖液，10ul 氯胺 T 溶液，如需碘化標記時再加 15ulNa125I
3) 混合物于 25℃ 振搖 25 min
4) 加入 l00ul5 mmol/LNa2S2O5 及 200ul100 mmol/LKI，以終止反應
5) 將反應產物中的碘化物去除. 經 SephadexG-25 柱層析, 洗脫緩沖液為 NET
6) 洗脫收集液用無水乙醇沉淀，沉淀時加入 100ul 酵母 tRNA 為載體。
7) 在 4℃ 下，10000r/min 離心 30 min
8) 再在沉淀屮加入乙醇洗兩次，離心同 7)。
9) 沉淀復溶于 NET 緩沖液。
10) 蔗糖密度梯度超離心，取 500ul RNA 樣品加入 4 ml15% 至 30% 用 NET 緩沖液制備的蔗糖禪度溶液。在 7℃下，310000r/min 比離心 2.33 h。離心后可見 4 個峰，即 4S、18S、28S 及 35S. 酶特異性實驗證明，35S 部分對 DNA 酶不敏感，而對 RNA 酶敏感，因此，這一部分被證明是 HAVRNA。
3）Poly(A)+RNA 的提取
經上述酚：氯仿：辛醇及密度梯度超離心后，對于所收集的 35SRNA 部分可釆用下列方法分離含多聚 (A) 的 HAVRNA。
1) 寡聚脫氧胸苷 (oligo-dT) 纖維素柱層析分離法。①柱床根據分離暈而定，如 0.5 cmX2 cm 或 lcmX4.5 cm 等。②用纖維素柱平衡液平衡纖維素。③裝柱，以無菌的三蒸水和 0.lmol/L NaOH 及 5 mmol/L EDTA 循環洗三次，最后以水洗，再用含 0.lmol/L NaCl 的平衡液洗一次。④加樣，樣品用無菌的三蒸水稀釋，水浴處理 5mim, 冷卻, 加入柱內⑤用 2?3 倍柱體積的 TES 緩沖液洗脫，收集洗脫液，洗脫至 A260<0.03。⑥收集 A260 峰值部分，加 3moL/LNaAc 及 2.5 倍體積的乙醇，一 20℃ 放置⑦在4℃，10000r/min 離心 30 min.⑧沉淀復溶于水，測 OD 值，計算 RNA 含暈，即得含多聚（A) 的 HAVRNA
2) 多聚尿嘧啶核苷柱（polyuridyncaad-Sepharcst-4B) 層析法。實驗操作方法及步驟與 1) 法基本相同。柱床為 lcmX2 cm, 柱層平衡液為 1 份甲酰胺及 3 份 NET 緩沖液，平衡和洗層析柱 5 次. 含多聚（A)RNA 洗脫收集液為 9 份甲酰胺及 1 份的 NET 緩沖液，RNA 洗脫收集后，沉淀、濃縮及干燥。RNA 樣品應儲存于-70℃ 備用.