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  • 發布時間:2019-08-02 22:56 原文鏈接: 甲醛變性電泳檢測RNA完整性

    一、材料、試劑和儀器

    1、材料:植物總RNA 5-10μg

    2、試劑:

    1)加樣運載緩沖液(Loading buffer)

    50% 甘油
    1mmol/L EDTA (pH 8.0)
    0.25%溴酚藍
    25%二甲苯氰FF

    2)10×TAE Buffer

    3)5×甲醛凝膠電泳緩沖液:

    0.1mol/L MOPs (pH7.0)
    40mmol/L乙酸鈉
    5mmol/L DETA(pH8.0)

    4)甲醛,甲酰胺

    3、儀器:電泳裝置,紫外透射觀測儀

    二、實驗程序

    1、甲醛變性的瓊脂糖(Agarose) 凝膠的配制

    在250mL的錐形瓶中準確稱量2g Agarose (Sigama),再加20mL 10×TAE Buffer,144mLDEPC處理過的雙蒸水,微波爐中化膠,待冷卻至50-60℃加EB至終濃度≤0.5μg/mL。在通風櫥中加入36 mL甲醛,放置一段時間以減少甲醛蒸汽。

    2、RNA的甲醛變性電泳

    1) 樣品制備

    RNA總量10μg
    5×甲醛凝膠電泳緩沖液4μl
    甲醛 3.5μl
    甲酰胺10μl

    加入無菌離心管中混合,95℃水浴變性2min(或55℃,15min),取出后放入冰中冷卻。

    2) 加入2μl無菌的DEPC處理的加樣運載液。(使用加樣運載液的目的有三: 增大樣品密度,以確保DNA均勻進入樣品孔內;使樣品呈現顏色,便于加樣操作;能明確顯現樣品在電泳膠上的泳動位置。以 0.5 X TBE作電泳液時,溴苯酚在瓊脂糖中的泳動速率與長 300 bp 的雙鏈線狀DNA相同,而二甲苯氰FF 的泳動速率與長4kb 的雙鏈線狀DNA相同。)

    3)將膠板浸沒在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中,點樣前5V/cm預跑5min。點樣后3-4V/cm電泳。

    4)電泳結束后(溴苯酚藍遷移到約8cm處),紫外燈下觀察, 照相。


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