電泳技術發展簡史

　　1809年俄國物理學家Рейсе首次發現電泳現象。他在濕粘土中插上帶玻璃管的正負兩個電極，加電壓后發現正極玻璃管中原有的水層變混濁，即帶負電荷的粘土顆粒向正極移動，這就是電泳現象。

　　1909年Michaelis首次將膠體離子在電場中的移動稱為電泳。他用不同pH的溶液在U形管中測定了轉化酶和過氧化氫酶的電泳移動和等電點。

　　1937年瑞典Uppsala大學的Tiselius對電泳儀器作了改進，創造了Tiselius電泳儀，建立了研究蛋白質的移動界面電泳方法，并首次證明了血清是由白蛋白及α、β、γ球蛋白組成的，由于Tiselius在電泳技術方面作出的開拓性貢獻而獲得了1948年的諾貝爾化學獎。

　　1948年Wieland和Fischer重新發展了以濾紙作為支持介質的電泳方法，對氨基酸的分離進行過研究。

　　從本世紀50年代起，特別是1950年Durrum用紙電泳進行了各種蛋白質的分離以后，開創了利用各種固體物質(如各種濾紙、醋酸纖維素薄膜、瓊脂凝膠、淀粉凝膠等)作為支持介質的區帶電泳方法。

　　1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝膠作為支持介質，創建了聚丙烯酰胺凝膠電泳，極大地提高了電泳技術的分辨率，開創了近代電泳的新時代。30多年來，聚丙烯酰胺凝膠電泳仍是生物化學和分子生物學中對蛋白質、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鑒定技術，是檢驗生化物質的最高純度：即“電泳純”(一維電泳一條帶或二維電泳一個點)的標準分析鑒定方法，至今仍被人們稱為是對生物大分子進行分析鑒定的最后、最準確的手段，即“Last Check”。

　　由80年代發展起來的新的毛細管電泳技術，是化學和生化分析鑒定技術的重要新發展，己受到人們的充分重視。

　　電泳的基本原理

　　電泳是指帶電顆粒在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。電泳技術就是利用在電場的作用下，由于待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而對樣品進行分離、鑒定或提純的技術。

　　電泳過程必須在一種支持介質中進行。Tiselius等在1937年進行的自由界面電泳沒有固定支持介質，所以擴散和對流都比較強，影響分離效果。于是出現了固定支持介質的電泳，樣品在固定的介質中進行電泳過程，減少了擴散和對流等干擾作用。最初的支持介質是濾紙和醋酸纖維素膜，目前這些介質在實驗室已經應用得較少。在很長一段時間里，小分子物質如氨基酸、多肽、糖等通常用濾紙或纖維素、硅膠薄層平板為介質的電泳進行分離、分析，但目前則一般使用更靈敏的技術如HPLC等來進行分析。這些介質適合于分離小分子物質，操作簡單、方便。但對于復雜的生物大分子則分離效果較差。凝膠作為支持介質的引入大大促進了電泳技術的發展，使電泳技術成為分析蛋白質、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝膠是淀粉凝膠，但目前使用得最多的是瓊脂糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠。蛋白質電泳主要使用聚丙烯酰胺凝膠。

　　電泳裝置主要包括兩個部分：電源和電泳槽。電源提供直流電，在電泳槽中產生電場，驅動帶電分子的遷移。電泳槽可以分為水平式和垂直式兩類。垂直板式電泳是較為常見的一種，常用于聚丙烯酰胺凝膠電泳中蛋白質的分離。電泳槽中間是夾在一起的兩塊玻璃板，玻璃板兩邊由塑料條隔開，在玻璃平板中間制備電泳凝膠，凝膠的大小通常是12cm ′ 14 cm，厚度為1mm～2 mm，近年來新研制的電泳槽，膠面更小、更薄，以節省試劑和縮短電泳時間。制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子，在膠聚合后移去，形成上樣品的凹槽。水平式電泳，凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上，用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液，或將凝膠直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變，進而影響其電泳遷移的速度，所以電泳過程應在適當的緩沖液中進行的，緩沖液可以保持待分離物的帶電性質的穩定。

　　為了更好的了解帶電分子在電泳過程中是如何被分離的，下面簡單介紹一下電泳的基本原理。在兩個平行電極上加一定的電壓(V)，就會在電極中間產生電場強度(E)，

　　上式中L是電極間距離。在稀溶液中，電場對帶電分子的作用力(F)，等于所帶凈電荷與電場強度的乘積：

　　上式中q是帶電分子的凈電荷，E是電場強度。

　　這個作用力使得帶電分子向其電荷相反的電極方向移動。在移動過程中，分子會受到介質粘滯力的阻礙。粘滯力(F’)的大小與分子大小、形狀、電泳介質孔徑大小以及緩沖液粘度等有關，并與帶電分子的移動速度成正比，對于球狀分子，F’的大小服從Stokes定律，即：F’=6πrηυ

　　式中r是球狀分子的半徑，η是緩沖液粘度，υ是電泳速度(υ= d / t，單位時間粒子運動的距離，cm / s )。當帶電分子勻速移動時： F = F’，∴ q?E = 6πrηυ

　　電泳遷移率(m)是指在單位電場強度(1V/cm)時帶電分子的遷移速度：

　　所以： 這就是遷移率公式，由上式可以看出，遷移率與帶電分子所帶凈電荷成正比，與分子的大小和緩沖液的粘度成反比。

　　用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量時，實際使用的是相對遷移率mR。即：

　　上式中：d-帶電粒子泳動的距離，t-電泳的時間，V-電壓，L-兩電極交界面之間的距離，即凝膠的有效長度。 因此，相對遷移率mR就是兩種帶電粒子在凝膠中泳動遷移的距離之比。

　　帶電分子由于各自的電荷和形狀大小不同，因而在電泳過程中具有不同的遷移速度，形成了依次排列的不同區帶而被分開。即使兩個分子具有相似的電荷，如果它們的分子大小不同，由于它們所受的阻力不同，因此遷移速度也不同，在電泳過程中就可以被分離。有些類型的電泳幾乎完全依賴于分子所帶的電荷不同進行分離，如等電聚焦電泳;而有些類型的電泳則主要依靠分子大小的不同即電泳過程中產生的阻力不同而得到分離，如SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。分離后的樣品通過各種方法的染色，或者如果樣品有放射性標記，則可以通過放射性自顯影等方法進行檢測。

　　影晌電泳分離的主要因素

　　由電泳遷移率的公式可以看出，影響電泳分離的因素很多，下面簡單討論一些主要的影響因素：

　　1. 待分離生物大分子的性質

　　待分離生物大分子所帶的電荷、分子大小和性質都會對電泳有明顯影響。一般來說，分子帶的電荷量越大、直徑越小、形狀越接近球形，則其電泳遷移速度越快。

　　2. 緩沖液的性質

　　緩沖液的pH值會影響待分離生物大分子的解離程度，從而對其帶電性質產生影響，溶液pH值距離其等電點愈遠，其所帶凈電荷量就越大，電泳的速度也就越大，尤其對于蛋白質等兩性分子，緩沖液pH還會影響到其電泳方向，當緩沖液pH大于蛋白質分子的等電點，蛋白質分子帶負電荷，其電泳的方向是指向正極。為了保持電泳過程中待分離生物大分子的電荷以及緩沖液pH值的穩定性，緩沖液通常要保持一定的離子強度，一般在0.02-0.2，離子強度過低，則緩沖能力差，但如果離子強度過高，會在待分離分子周圍形成較強的帶相反電荷的離子擴散層(即離子氛)，由于離子氛與待分離分子的移動方向相反，它們之間產生了靜電引力，因而引起電泳速度降低。另外緩沖液的粘度也會對電泳速度產生影響。

　　3. 電場強度

　　電場強度(V/cm)是每厘米的電位降，也稱電位梯度。電場強度越大，電泳速度越快。但增大電場強度會引起通過介質的電流強度增大，而造成電泳過程產生的熱量增大。電流在介質中所做的功(W)為：

　　W=I2.R.t

　　上式中：I為電流強度，R為電阻，t為電泳時間。

　　電流所作的功絕大部分都轉換為熱，因而引起介質溫度升高，這會造成很多影響：

　　①樣品和緩沖離子擴散速度增加，引起樣品分離帶的加寬;②產生對流，引起待分離物的混合;③如果樣品對熱敏感，會引起蛋白變性;④引起介質粘度降低、電阻下降等等。電泳中產生的熱通常是由中心向外周散發的，所以介質中心溫度一般要高于外周，尤其是管狀電泳，由此引起中央部分介質相對于外周部分粘度下降，摩擦系數減小，電泳遷移速度增大，由于中央部分的電泳速度比邊緣快，所以電泳分離帶通常呈弓型。降低電流強度，可以減小生熱，但會延長電泳時間，引起待分離生物大分子擴散的增加而影響分離效果。所以電泳實驗中要選擇適當的電場強度，同時可以適當冷卻降低溫度以獲得較好的分離效果。

　　4. 電滲

　　液體在電場中，對于固體支持介質的相對移動，稱為電滲現象。由于支持介質表面可能會存在一些帶電基團，如濾紙表面通常有一些羧基，瓊脂可能會含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基團等等。這些基團電離后會使支持介質表面帶電，吸附一些帶相反電荷的離子，在電場的作用下向電極方向移動，形成介質表面溶液的流動，這種現象就是電滲。在pH值高于3時，玻璃表面帶負電，吸附溶液中的正電離子，引起玻璃表面附近溶液層帶正電，在電場的作用下，向負極遷移，帶動電極液產生向負極的電滲流。如果電滲方向與待分離分子電泳方向相同，則加快電泳速度;如果相反，則降低電泳速度。

　　5. 支持介質的篩孔

　　支持介質的篩孔大小對待分離生物大分子的電泳遷移速度有明顯的影響。在篩孔大的介質中泳動速度快，反之，則泳動速度慢。

　　電泳的分類

　　電泳按其分離的原理不同可分為：

　　⑴ 區帶電泳：電泳過程中，待分離的各組分分子在支持介質中被分離成許多條明顯的區帶，這是當前應用最為廣泛的電泳技術。

　　⑵ 自由界面電泳： 這是瑞典Uppsala大學的著名科學家Tiselius最早建立的電泳技術，是在U形管中進行電泳，無支持介質，因而分離效果差，現已被其他電泳技術所取代。

　　⑶ 等速電泳：需使用專用電泳儀，當電泳達到平衡后，各電泳區帶相隨，分成清晰的界面，并以等速向前運動。

　　⑷ 等電聚焦電泳：由兩性電解質在電場中自動形成pH梯度，當被分離的生物大分子移動到各自等電點的pH處聚集成很窄的區帶。

　　按支持介質的不同可分為：

　　⑴ 紙電泳(Paper electrophorisis)

　　⑵ 醋酸纖維薄膜電泳(Cellulose Acetate electrophoresis)

　　⑶ 瓊脂凝膠電泳(Agar Gel electrophoresis)

　　⑷ 聚丙烯酰胺凝膠電泳(Polyacrylamide Gel electrophoresis)(PAGE)

　　⑸ SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。

　　按支持介質形狀不同可它為：

　　⑴ 薄層電泳 ; ⑵ 板電泳 ; ⑶ 柱電泳。

　　按用途不同可分為：

　　⑴ 分析電泳; ⑵ 制備電泳; ⑶ 定量免疫電泳; ⑷ 連續制備電泳。

　　按所用電壓不同可分為：

　　⑴ 低壓電泳：100V～500V，電泳時間較長，適于分離蛋白質等生物大分子。

　　⑵ 高壓電泳：1000V～5000V，電泳時間短，有時只需幾分鐘，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖類等小分子物質的分離

　　紙電泳和醋酸纖維薄膜電泳

　　紙電泳是用濾紙作支持介質的一種早期電泳技術。盡管分辨率比凝膠介質要差，但由于其操作簡單，所以仍有很多應用，特別是在血清樣品的臨床檢測和病毒分析等方面有重要用途。

　　紙電泳使用水平電泳槽。分離氨基酸和核苷酸時常用pH 2～3.5的酸性緩沖液，分離蛋白質時常用堿性緩沖液。選用的濾紙必須厚度均勻，常用國產新華濾紙和進口的Whatman 1號濾紙。點樣位置是在濾紙的一端距紙邊5cm～10cm處。樣品可點成園形或長條形，長條形的分離效果較好。點樣量為5mg～100mg和 5ml～10ml。點樣方法有干點法和濕點法。濕點法是在點樣前即將濾紙用緩沖液浸濕，樣品液要求較濃，不亦多次點樣。干點法是在點樣后再用緩沖液和噴霧器將濾紙噴濕，點樣時可用吹風機吹干后多次點樣，因而可以用較稀的樣品。電泳時要選擇好正、負極，電壓通常使用2～10 V/cm的低壓電泳，電泳時間較長。對于氨基酸和肽類等小分子物質，則要使用50～200 V/cm的高壓電泳，電泳時間可以大大縮短，但必須解決電泳時的冷卻問題，并要注意安全。

　　電泳完畢記下濾紙的有效使用長度，然后烘干，用顯色劑顯色，顯色劑和顯色方法，可查閱有關書藉。定量測定的方法有洗脫法和光密度法。洗脫法是將確定的樣品區帶剪下，用適當的洗脫劑洗脫后進行比色或分光光度測定。光密度法是將染色后的干濾紙用光密度計直接定量測定各樣品電泳區帶的含量。

　　醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相似，只是換用了醋酸纖維薄膜作為支持介質。將纖維素的羥基乙酰化為醋酸酯，溶于丙酮后涂布成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm。

　　醋酸纖維薄膜電泳與紙電泳相比有以下優點：① 醋酸纖維薄膜對蛋白質樣品吸附極少，無“拖尾”現象，染色后蛋白質區帶更清晰。② 快速省時。由于醋酸纖維薄膜親水性比濾紙小，吸水少，電滲作用小，電泳時大部分電流由樣品傳導，所以分離速度快，電泳時間短，完成全部電泳操作只需90 min左右。③ 靈敏度高，樣品用量少。血清蛋白電泳僅需 2ml 血清，點樣量甚至少到0. 1ml，僅含5mg的蛋白樣品也可以得到清晰的電泳區帶。臨床醫學用于檢測微量異常蛋白的改變。④ 應用面廣。可用于那些紙電泳不易分離的樣品，如胎兒甲種球蛋白、溶菌酶、胰島素、組蛋白等。⑤ 醋酸纖維薄膜電泳染色后，用乙酸、乙醇混合液浸泡后可制成透明的干板，有利于光密度計和分光光度計掃描定量及長期保存。

　　由于醋酸纖維薄膜電泳操作簡單、快速、價廉，目前已廣泛用于分析檢測血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、胎兒甲種球蛋白、體液、脊髓液、脫氫酶、多肽、核酸及其他生物大分子，為心血管疾病、肝硬化及某些癌癥鑒別診斷提供了可靠的依據，因而已成為醫學和臨床檢驗的常規技術。

　　瓊脂糖凝膠電泳

　　瓊脂糖是從瓊脂中提純出來的，主要是由D-半乳糖和3,6脫水L-半乳糖連接而成的一種線性多糖。瓊脂糖凝膠的制作是將干的瓊脂糖懸浮于緩沖液中，通常使用的濃度是1%-3%，加熱煮沸至溶液變為澄清，注入模板后室溫下冷卻凝聚即成瓊脂糖凝膠。瓊脂糖之間以分子內和分子間氫鍵形成較為穩定的交聯結構，這種交聯的結構使瓊脂糖凝膠有較好的抗對流性質。瓊脂糖凝膠的孔徑可以通過瓊脂糖的最初濃度來控制，低濃度的瓊脂糖形成較大的孔徑，而高濃度的瓊脂糖形成較小的孔徑。盡管瓊脂糖本身沒有電荷，但一些糖基可能會被羧基、甲氧基特別是硫酸根不同程度的取代，使得瓊脂糖凝膠表面帶有一定的電荷，引起電泳過程中發生電滲以及樣品和凝膠間的靜電相互作用，影響分離效果。市售的瓊脂糖有不同的提純等級，主要以硫酸根的含量為指標，硫酸根的含量越少，提純等級越高。

　　瓊脂糖凝膠可以用于蛋白質和核酸的電泳支持介質，尤其適合于核酸的提純、分析。如濃度為1%的瓊脂糖凝膠的孔徑對于蛋白質來說是比較大的，對蛋白質的阻礙作用較小，這時蛋白質分子大小對電泳遷移率的影響相對較小，所以適用于一些忽略蛋白質大小而只根據蛋白質天然電荷來進行分離的電泳技術，如免疫電泳、平板等電聚焦電泳等。瓊脂糖也適合于DNA、RNA分子的分離、分析，由于DNA、RNA分子通常較大，所以在分離過程中會存在一定的摩擦阻礙作用，這時分子的大小會對電泳遷移率產生明顯影響。例如對于雙鏈DNA，電泳遷移率的大小主要與DNA分子大小有關，而與堿基排列及組成無關。另外，一些低熔點的瓊脂糖(62 ~ 65 °C)可以在65 °C時熔化，因此其中的樣品如DNA可以重新溶解到溶液中而回收。

　　由于瓊脂糖凝膠的彈性較差，難以從小管中取出，所以一般瓊脂糖凝膠不適合于管狀電泳，管狀電泳通常采用聚丙烯酰胺凝膠。瓊脂糖凝膠通常是形成水平式板狀凝膠，用于等電聚焦、免疫電泳等蛋白質電泳，以及DNA、RNA的分析。垂直式電泳應用得相對較少。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳簡稱為PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由單體的丙烯酰胺(CH2=CHCONH2 Acrylamide)和甲叉雙丙烯酰胺(CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide)聚合而成，這一聚合過程需要有自由基催化完成。常用的催化聚合方法有兩種：化學聚合和光聚合。化學聚合通常是加入催化劑過硫酸銨(AP)以及加速劑四甲基乙二胺(TEMED)，四甲基乙二胺催化過硫酸銨產生自由基：

　　以R?代表自由基，M代表丙烯酰胺單體，則聚合過程可以表示為：

　　etc.

　　這樣由于乙烯基“CH2=CH-”一個接一個的聚合作用就形成丙烯酰胺長鏈，同時甲叉雙丙烯酰胺在不斷延長的丙烯酰胺鏈間形成甲叉鍵交聯，從而形成交聯的三維網狀結構。氧氣對自由基有清除作用，所以通常凝膠溶液聚合前要進行抽氣。丙烯酰胺的另一種聚合方法是光聚合，催化劑是核黃素，核黃素在光照下能夠產生自由基，催化聚合反應。一般光照2-3小時即可完成聚合反應。

　　聚丙烯酰胺的凝膠網絡如下圖所示：

　　聚丙烯酰胺凝膠的孔徑可以通過改變丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的濃度來控制，丙烯酰胺的濃度可以在3%-30%之間。低濃度的凝膠具有較大的孔徑，如3%的聚丙烯酰胺凝膠對蛋白質沒有明顯的阻礙作用，可用于平板等電聚焦或SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的濃縮膠，也可以用于分離DNA;高濃度凝膠具有較小的孔徑，對蛋白質有分子篩的作用，可以用于根據蛋白質的分子量進行分離的電泳中，如10%-20%的凝膠常用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的分離膠。

　　聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是：

　　上式中a為丙烯酰胺的克數，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數，m為水或緩沖液體積(ml)。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應在30左右。選擇T和C的經驗公式是：

　　C = 6.5-0.3T

　　此式可用于計算T為5%～20%時的凝膠組成。C值并不很嚴格，在大多數情況下，可變化的范圍約為 ±1%，當C保持恒定時，凝膠的有效孔徑隨著T的增加而減小，當T保持恒定，C為4%時，有效孔徑最小，C大于或小于4%時，有效孔徑均變大，C大于5%時凝膠變脆，不宜使用，實驗中最常用的C是2.6%和3%。

　　配成30%的丙烯酰胺水溶液在4℃下能保存1個月，在貯存期間丙烯酰胺會水解為丙烯酸而增加電泳時的電內滲現象并減慢電泳的遷移率。丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是一種對中樞神經系統有毒的試劑，操作時要避免直接接觸皮膚，但它們聚合后則無毒。

　　未加SDS的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳可以使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷，它們的分離是依據其電泳遷移率的不同和凝膠的分子篩作用，因而可以得到較高的分辨率，尤其是在電泳分離后仍能保持蛋白質和酶等生物大分子的生物活性，對于生物大分子的鑒定有重要意義，其方法是在凝膠上進行兩份相同樣品的電泳，電泳后將凝膠切成兩半，一半用于活性染色，對某個特定的生物大分子進行鑒定，另一半用于所有樣品的染色，以分析樣品中各種生物大分子的種類和含量。

　　由于聚丙烯酰胺凝膠有突出的優點，因而四十年來得到廣泛的應用，目前尚無更好的支持介質能夠取代它。其主要的優點有：①可以隨意控制膠濃度“T”和交聯度“C”，從而得到不同的有效孔徑，用于分離不同分子量的生物大分子。②能把分子篩作用和電荷效應結合在同一方法中，達到更高的靈敏度：10-9 ～10-12 mol/L。③由于聚丙烯酰胺凝膠是由-C-C-鍵結合的酰胺多聚物，側鏈只有不活潑的酰胺基-CO-NH2 ，沒有帶電的其他離子基團，化學惰性好，電泳時不會產生“電滲”。④由于可以制得高純度的單體原料，因而電泳分離的重復性好。⑤透明度好，便于照相和復印。機械強度好，有彈性，不易碎，便于操作和保存。⑥無紫外吸收，不染色就可以用于紫外波長的凝膠掃描作定量分析。⑦還可以用作固定化酶的惰性載體。

　　聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質最初是在玻璃管中進行的，玻璃管通常直徑為7 mm，長10 cm，將凝膠裝入到多個管中進行電泳，又稱為柱狀電泳。目前仍有應用，尤其用于二維電泳中的第一維電泳。但由于各個玻璃管的不同以及裝膠時的差異使每管的分離條件會有所差異，所以對各管樣品進行比較時可能會出現較大誤差。后來發展起來的垂直平板電泳一次最多可以容納20個樣品，電泳過程中樣品所處的條件比較一致，樣品間可以進行更好的比較，重復性也更好，所以垂直平板電泳目前應用的更為廣泛，常用于蛋白質及DNA序列分析過程中DNA片段的分離、鑒定。

　　水平平板電泳近年來也有很快的發展，與垂直平板電泳相比也有其獨特的優點：①由于凝膠可以直接鋪在冷卻板上，容易使凝膠冷卻，因而可以加高電壓以提高分辨率。②電泳速度快，通常只要1小時左右，而園盤電泳和垂直平板電泳一般需要3～4小時。③因為可以使用薄膠，加樣少，染色快，從而提高了靈敏度，而且容易保存，只要用甘油浸泡后自然干燥即可長期保存不會龜裂。④便于適用各種電泳方式，用途廣泛，尤其是可以使用90年代才發展起來的只有水平電泳系統才能使用的新的半干技術，即用浸有少量緩沖液的半干的膠條代替通常所用的大量電極緩沖液，大大節約了試劑，簡化了操作，提高了電泳速度。

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質的電泳方法，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。

　　SDS-PAGE 是在要走電泳的樣品中加入含有SDS和b-巰基乙醇的樣品處理液，SDS即十二烷基磺酸鈉(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+)，是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構，強還原劑b-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮3～5 min，使SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構。SDS與蛋白質結合后使蛋白質-SDS復合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，這時各種蛋白質分子本身的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。

　　制備凝膠時首先要根據待分離樣品的情況選擇適當的分離膠濃度，例如通常使用的15%的聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍是104～105，即分子量小于104的蛋白質可以不受孔徑的阻礙而通過凝膠，而分子量大于105的蛋白質則難以通過凝膠孔徑，這兩種情況的蛋白質都不能得到分離。所以如果要分離較大的蛋白質，需要使用低濃度如 10%或7.5%的凝膠(孔徑較大);而對于分離較小的蛋白質，使用的較高濃度凝膠(孔徑較小)可以得到更好的分離效果。分離膠聚合后，通常在上面加上一層濃縮膠(約1 cm)，并在濃縮上插入樣品梳，形成上樣凹槽。濃縮膠是低濃度的聚丙烯酰胺凝膠，由于濃縮膠具有較大的孔徑(丙烯酰胺濃度通常為3～5%)，各種蛋白質都可以不受凝膠孔徑阻礙而自由通過。濃縮膠通常pH值較低(通常pH = 6.8)，用于樣品進入分離膠前將樣品濃縮成很窄的區帶。濃縮膠聚合后取出樣品梳，上樣后即可通電開始電泳。

　　聚丙烯酰胺凝膠電泳和SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳有兩種系統，即只有分離膠的連續系統和有濃縮膠與分離膠的不連續系統，不連續系統中最典型、國內外均廣泛使用的是著名的Ornstein-Davis 高pH堿性不連續系統，其濃縮膠丙烯酰胺濃度為4%，pH = 6.8，分離膠的丙烯酰胺濃度為12.5%，pH = 8.8。電極緩沖液的pH = 8.3，用Tris、SDS和甘氨酸配制。配膠的緩沖液用Tris、SDS和HCl配制。

　　樣品在電泳過程中首先通過濃縮膠，在進入分離膠前由于等速電泳現象而被濃縮。這是由于在電泳緩沖液中主要存在三種陰離子，Cl-、甘氨酸陰離子以及蛋白質-SDS復合物，在濃縮膠的pH值下，甘氨酸只有少量的電離，所以其電泳遷移率最小，而Cl-的電泳遷移率最大。在電場的作用下，Cl-最初的遷移速度最快，這樣在Cl-后面形成低離子濃度區域，即低電導區，而低電導區會產生較高的電場強度，因此Cl-后面的離子在較高的電場強度作用下會加速移動。達到穩定狀態后，Cl-和甘氨酸之間形成穩定移動的界面。而蛋白質-SDS復合物由于相對量較少，聚集在甘氨酸和Cl-的界面附近而被濃縮成很窄的區帶(可以被濃縮三百倍)，所以在濃縮膠中Cl-是快離子(前導離子)，甘氨酸是慢離子(尾隨離子)。

　　當甘氨酸到達分離膠后，由于分離膠的pH值(通常pH = 8.8)較大，甘氨酸離解度加大，電泳遷移速度變大超過蛋白質-SDS復合物，甘氨酸和Cl-的界面很快超過蛋白質-SDS復合物。這時蛋白質-SDS復合物在分離膠中以本身的電泳遷移速度進行電泳，向正極移動。由于蛋白質-SDS復合物在單位長度上帶有相等的電荷，所以它們以相等的遷移速度從濃縮膠進入分離膠，進入分離膠后，由于聚丙烯酰胺的分子篩作用，小分子的蛋白質可以容易的通過凝膠孔徑，阻力小，遷移速度快;大分子蛋白質則受到較大的阻力而被滯后，這樣蛋白質在電泳過程中就會根據其各自分子量的大小而被分離。溴酚藍指示劑是一個較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑，所以它顯示著電泳的前沿位置。當指示劑到達凝膠底部時，停止電泳，從平板中取出凝膠。在適當的染色液中(如通常使用的考馬斯亮藍)染色幾個小時，而后過夜脫色。脫色液去除凝膠中未與蛋白結合的背底染料，這時就可以清晰地觀察到凝膠中被染色的蛋白質區帶。通常凝膠制備需要1～1.5小時，電泳在25～30mA下通常需要3小時，染色2～3 小時，過夜脫色。通常使用的垂直平板電泳可以同時進行多個樣品的電泳。

　　Ornstein和Davis設計的高pH堿性不連續系統，有其獨特的特點。根據Henderson-Hasselbalch公式：

　　式中的“α”是緩沖液中各種分子的離解度。由上式可以看出：① 濃縮膠的pH(6.8)小于慢離子甘氨酸的pKa(9.8)3個pH左右，所以 α≈ 0.001，即在濃縮膠中甘氨酸只有0.1%離解，因此在電場中遷移很慢，是慢離子。② 快離子Cl-由于幾乎全部離解，電泳遷移率最大，不受pH變化的影響。③ 分離膠的pH(8.8)小于慢離子的pKa 一個pH左右，α≈ 0.1，所以在分離膠中甘氨酸離解加大，電泳遷移率加大，就趕到蛋白質帶的前面。

　　此外還可以總結出該系統的特點有：④ 電極緩沖液中共軛堿Tris的pKa小于分離膠的pH約1個pH，使其緩沖能力大。⑤電極緩沖液的pH為8.3，相近于Tris的pKa(8.1)，以便獲得最大的緩沖能力。

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測定，在同一凝膠上對一系列已知分子量的標準蛋白及未知蛋白進行電泳，測定各個的標準蛋白的電泳距離(或遷移率)，并對各自分子量的對數(log Mr)作圖，即得到標準曲線。測定未知蛋白質的電泳距離(或遷移率)，通過標準曲線就可以求出未知蛋白的分子量。

　　SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳經常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。

　　梯度凝膠電泳

　　梯度凝膠電泳也通常采用聚丙烯酰胺凝膠，但不是在單一濃度(孔徑)的凝膠上進行，而是形成梯度凝膠。從凝膠頂部到底部丙烯酰胺的濃度呈梯度變化，如通常頂部凝膠濃度為5%，底部凝膠濃度為25%。凝膠梯度是通過梯度混合器形成的，高濃度的丙烯酰胺溶液首先加入到玻璃平板中，而后溶液濃度呈梯度下降，因此在凝膠的頂部孔徑較大，而在凝膠的底部孔徑較小。梯度凝膠電泳也通常加入SDS，并有濃縮膠。電泳過程與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳基本類似。與單一濃度的凝膠相比，梯度凝膠有幾個優點：①首先，梯度凝膠比單一濃度凝膠的分離范圍更寬，可以同時分離較大范圍分子量的蛋白質。單一凝膠電泳對于分子量超過其分離范圍的蛋白質，過大或過小，都不能分離。而梯度凝膠孔徑范圍比單一凝膠大，分子量較大的蛋白質可以在凝膠頂部大孔徑部分得到分離，而分子量較小的蛋白質可以在凝膠底部小孔徑部分得到分離，所以分子量較大和較小的蛋白質可以同時得到分離。例如用4%～30%的梯度膠可以分離分子量5萬～200萬的蛋白質。② 另一個優點是梯度凝膠可以分辨分子量相差較小，在單一濃度凝膠中不能分辨的蛋白質。電泳過程中，蛋白質在梯度凝膠中遷移，經過的孔徑越來越小，直到凝膠的孔徑不能通透，這樣電泳過程中蛋白質就被濃縮，集中在一個很窄的區帶中。而分子量略小的蛋白質可以遷移得更靠前一些，被集中在略前面的區帶中。由于梯度凝膠孔徑逐步變小，在蛋白質不能通透的孔徑附近對蛋白有濃縮作用，所以電泳后形成很窄的區帶，可以分辨出分子量相差較小的蛋白質。對于太稀的樣品，在電泳過程中可以將樣品分幾次加樣，大小不同的蛋白質分子最終都會滯留在其相應的凝膠孔徑中而得到分離。③ 可以直接測定天然狀態蛋白質的分子量而不需要解離為亞基，因此這一方法可以與SDS-PAGE測定分子量的方法互為補充。

　　梯度凝膠電泳主要適用于測定球蛋白的分子量，而對纖維蛋白將產生較大的誤差。由于分子量的測定必須是在未知和標準蛋白質分子到達完全被阻止遷移的孔徑時才能成立，因此電泳時要使用較高的電壓，例如平板凝膠為0.5mm厚，使用600V電壓， 50mA電流，電泳時間約需2小時。

　　等電聚焦

　　等電聚焦電泳是根據兩性物質等電點(pI)的不同而進行分離的，它具有很高的分辨率，可以分辨出等電點相差0.01的蛋白質，是分離兩性物質如蛋白質的一種理想方法。等電聚焦的分離原理是在凝膠中通過加入兩性電解質形成一個pH梯度，兩性物質在電泳過程中會被集中在與其等電點相等的pH區域內，從而得到分離。

　　兩性電解質是人工合成的一種復雜的多氨基-多羧基的混合物。不同的兩性電解質有不同的pH梯度范圍，既有較寬的范圍如pH=3～10，也有各種較窄的范圍如 pH=7～8。要根據待分離樣品的情況選擇適當的兩性電解質，使待分離樣品中各個組分都在兩性電解質的pH范圍內，兩性電解質的pH范圍越小，分辨率越高。

　　等電聚焦多采用水平平板電泳，也使用管式電泳。由于兩性電解質的價格昂貴，使用1～2 mm厚的凝膠進行等電聚焦價格較高。使用兩條很薄的膠帶做為玻璃板間隔，可以形成厚度僅0.15 mm的薄層凝膠，大大降低成本，所以等電聚焦通常使用這種薄層凝膠。由于等電聚焦過程需要蛋白質根據其電荷性質在電場中自由遷移，通常使用較低濃度的聚丙烯酰胺凝膠(如4%)以防止分子篩作用，也經常使用瓊脂糖，尤其是對于分子量很大的蛋白質。制作等電聚焦薄層凝膠時，首先將兩性電解質、核黃素與丙烯酰胺貯液混合，加入到帶有間隔膠條的玻璃板上，而后在上面加上另一塊玻璃板，形成平板薄層凝膠。經過光照聚合后，將一塊玻璃板橇開移去，將一小薄片濕濾紙分別置于凝膠兩側，連接凝膠和電極液(陽極為酸性如磷酸溶液，陰極為堿性如氫氧化鈉溶液)。接通電源，兩性電解質中不同的等電點的物質通過電泳在凝膠中形成 pH梯度，從陽極側到陰極側pH值由低到高呈線性梯度分布。而后關閉電源，上樣時取一小塊濾紙吸附樣品后放置在凝膠上，通電30 min后樣品通過電泳離開濾紙加入凝膠中，這時可以去掉濾紙。最初樣品中蛋白質所帶的電荷取決于放置樣品處凝膠的pH值，等電點在pH值以上的蛋白質帶正電，在電場的作用下向陰極移動，在遷移過程中，蛋白質所處的凝膠的pH值逐漸升高，蛋白質所帶的正電逐漸減少，到達pH=pI處的凝膠區域時蛋白質不帶電荷，停止遷移。同樣，等電點在上樣處凝膠pH以下的蛋白質帶負電，向陽極移動，最終到達pH=pI處的凝膠區域停止。可見等電聚焦過程無論樣品加在凝膠上什么位置，各種蛋白質都能向著其等電點處移動，并最終到達其等電點處，對最后的電泳結果沒有影響。所以有時樣品可以在制膠前直接加入到凝膠溶液中。使用較高的電壓(如2000V，0.5mm平板凝膠)可以得到較快速的分離(0.5～1小時)，但應注意對凝膠的冷卻以及使用恒定功率的電源。凝膠結束后對蛋白質進行染色時應注意，由于兩性電解質也會被染色，使整個凝膠都被染色。所以等電聚焦的凝膠不能直接染色，要首先經過10%的三氯乙酸的浸泡以除去兩性電解質后才能進行染色。

　　等電聚焦還可以用于測定某個未知蛋白質的等電點，將一系列已知等電點的標準蛋白(通常pI在3.5～10之間)及待測蛋白同時進行等電聚焦。測定各個標準蛋白電泳區帶到凝膠某一側邊緣的距離對各自的pI值作圖，即得到標準曲線。而后測定待測蛋白的距離，通過標準曲線即可求出其等電點。

　　等電聚焦具有很高的靈敏度，特別適合于研究蛋白質微觀不均一性，例如一種蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現單一帶，而在等電聚焦中表現三條帶。這可能是由于蛋白質存在單磷酸化、雙磷酸化和三磷酸化形式。由于幾個磷酸基團不會對蛋白質的分子量產生明顯的影響，因此在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中表現單一帶，但由于它們所帶的電荷有差異，所以在等電聚焦中可以被分離檢測到。同功酶之間可能只有一兩個氨基酸的差別，利用等電聚焦也可以得到較好的分離效果。由于等電聚焦過程中蛋白質通常是處于天然狀態的，所以可以通過前面介紹的活性染色的方法對酶進行檢測。等電聚焦主要用于分離分析，但也可以用于純化制備。雖然成本較高，但操作簡單、純化效率很高。除了通常的方法，制備性等電聚焦也可以在垂直玻璃管中的梯度蔗糖溶液或顆粒狀凝膠如 Sephadex G-75中進行。

　　二維聚丙烯酰胺凝膠電泳(2D―PAGE)

　　二維聚丙烯酰胺凝膠電泳技術結合了等電聚焦技術(根據蛋白質等電點進行分離)以及SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(根據蛋白質的大小進行分離)。這兩項技術結合形成的二維電泳是分離分析蛋白質最有效的一種電泳手段。通常第一維電泳是等電聚焦，在細管中(φ1～3 mm)中加入含有兩性電解質、8M的脲以及非離子型去污劑的聚丙烯酰胺凝膠進行等電聚焦，變性的蛋白質根據其等電點的不同進行分離。而后將凝膠從管中取出，用含有SDS的緩沖液處理30 min，使SDS與蛋白質充分結合。將處理過的凝膠條放在SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的瓊脂糖溶液使其固定并與濃縮膠連接。在第二維電泳過程中，結合SDS的蛋白質從等電聚焦凝膠中進入SDS-聚丙烯酰胺凝膠，在濃縮膠中被濃縮，在分離膠中依據其分子量大小被分離。這樣各個蛋白質根據等電點和分子量的不同而被分離、分布在二維圖譜上。細胞提取液的二維電泳可以分辨出1000～2000個蛋白質，有些報道可以分辨出 5000～10000個斑點，這與細胞中可能存在的蛋白質數量接近。由于二維電泳具有很高的分辨率，它可以直接從細胞提取液中檢測某個蛋白。例如將某個蛋白質的mRNA轉入到青蛙的卵母細胞中，通過對轉入和未轉入細胞的提取液的二維電泳圖譜的比較，轉入mRNA的細胞提取液的二維電泳圖譜中應存在一個特殊的蛋白質斑點，這樣就可以直接檢測mRNA的翻譯結果。二維電泳是一項很需要技術并且很辛苦的工作。目前已有一些計算機控制的系統可以直接記錄并比較復雜的二維電泳圖譜。

　　蛋白質的檢測、鑒定及回收

　　檢測蛋白質最常用的染色劑是考馬斯亮藍R-250(CBB，Coomassie brilliant blue)，通常是用甲醇：水：冰醋酸(體積比為45：45：10)配制0.1%或0.25%(W/V)的考馬斯亮藍溶液作為染色液。這種酸-甲醇溶液使蛋白質變性，固定在凝膠中，防止蛋白質在染色過程中在凝膠內擴散，通常染色需2小時。脫色液是同樣的酸-甲醇混合物，但不含染色劑，脫色通常需過夜搖晃進行。考馬斯亮藍染色具有很高的靈敏度，在聚丙烯酰胺凝膠中可以檢測到0.1 mg的蛋白質形成的染色帶。考馬斯亮藍與某些紙介質結合非常緊密，所以不能用于染色濾紙、醋酸纖維素薄膜以及蛋白質印跡(在硝化纖維素紙上)。在這種情況下通常是用10%的三氯乙酸浸泡使蛋白質變性，而后使用不對介質有強烈染色的染料如溴酚藍、氨基黑等對蛋白質進行染色。

　　銀染是比考馬斯亮藍染色更靈敏的一種方法，它是通過銀離子(Ag+)在蛋白質上被還原成金屬銀形成黑色來指示蛋白區帶的。銀染可以直接進行也可以在考馬斯亮藍染色后進行，這樣凝膠主要的蛋白帶可以通過考馬斯亮藍染色分辨，而細小的考馬斯亮藍染色檢測不到的蛋白帶由銀染檢測。銀染的靈敏度比考馬斯亮藍染色高100倍，可以檢測低于1 ng的蛋白質。

　　糖蛋白通常使用過碘酸-Schiff試劑(PAS)染色，但PAS染色不十分靈敏，染色后通常形成較淺的紅-粉紅帶，難以在凝膠中觀察。目前更靈敏的方法是將凝膠印跡后(下面介紹)用凝集素檢測糖蛋白。凝集素是從植物中提取的一類糖蛋白，它們能識別并選擇性的結合特殊的糖，不同的凝集素可以結合不同的糖。將凝膠印跡用凝集素處理，再用連接辣根過氧化物酶的抗凝集素抗體處理，然后再加入過氧化物酶的底物，通過生成有顏色的產物就可以檢測到凝集素結合情況。這樣凝膠印跡用不同的凝集素檢測不僅可以確定糖蛋白，而且可以得到糖蛋白中糖基的信息。

　　通過掃描光密度儀對染色的凝膠進行掃描可以進行定量分析，確定樣品中不同蛋白質的相對含量。掃描儀測定凝膠上不同遷移距離的吸光度值，各個染色的蛋白帶形成對應的峰，峰面積的大小可以代表蛋白質的含量的多少。另外一種簡單的方法是將染色的蛋白帶切下來，在一定體積的50%吡啶溶液中搖晃過夜溶解染料，而后通過分光光度計測定吸光度值就可以估算蛋白質的含量。但應注意，蛋白質只有在一定的濃度范圍內其含量才與吸光度值成線性關系，另外不同的蛋白質即使在含量相同的情況下染色程度也可能有所不同，所以上面的方法對蛋白質含量的測定只能是一種半定量的結果。

　　盡管凝膠電泳通常是作為一種分析工具使用，它也可以用于蛋白質的純化制備。但電泳后需將蛋白質從凝膠中回收，通常是將所需的蛋白質區帶部分的凝膠切下，通過電泳的方法將蛋白質從凝膠中洗脫下來(稱為電洗脫)。目前有各種商品電洗脫池裝置。最簡單的方法是將切下的凝膠裝入透析袋內加入緩沖液浸泡，再將透析袋浸入緩沖液中進行電泳，蛋白質就會向某個電極方向遷移而離開凝膠進入透析袋內的緩沖液。由于蛋白質不能通過透析袋，所以電泳后蛋白質就留在透析袋的緩沖液中。電洗脫后可通一個反向電流，持續幾秒鐘，使吸附在透析袋上的蛋白質進入緩沖液，這樣就可以將凝膠中的蛋白質回收。

　　蛋白質印跡(Western blotting)

　　印跡法(blotting)是指將樣品轉移到固相載體上，而后利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上，并利用 DNA-RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而后人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳后的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳后蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

　　蛋白質印跡法首先是要將電泳后分離的蛋白質從凝膠中轉移到硝酸纖維素膜上，通常有兩種方法：毛細管印跡法和電泳印跡法。毛細管印跡法是將凝膠放在緩沖液浸濕的濾紙上，在凝膠上放一片硝酸纖維素膜，再在上面放一層濾紙等吸水物質并用重物壓好，緩沖液就會通過毛細作用流過凝膠。緩沖液通過凝膠時會將蛋白質帶到硝酸纖維素膜上，硝酸纖維素膜可以與蛋白質通過疏水相互作用產生不可逆的結合。這個過程持續過夜，就可以將凝膠中的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜上。但這種方法轉移的效率較低，通常只能轉移凝膠中一小部分蛋白質(10%～20%)。電泳印跡可以更快速有效的進行轉移。這種方法是用有孔的塑料和有機玻璃板將凝膠和硝酸纖維素膜夾成“三明治”形狀，而后浸入兩個平行電極中間的緩沖液中進行電泳，選擇適當的電泳方向就可以使蛋白質離開凝膠結合在硝酸纖維素膜上。

　　轉移后的硝酸纖維素膜就稱為一個印跡(blot)，用于對蛋白質的進一步檢測。印跡首先用蛋白溶液(如10%的BSA)處理以封閉硝酸纖維素膜上剩余的疏水結合位點，而后用所要研究的蛋白質的抗血清(一抗)處理，印跡中只有待研究的蛋白質與一抗結合，而其它蛋白質不與一抗結合，這樣清洗去除未結合的一抗后，印跡中只有待研究的蛋白質的位置上結合著一抗。處理過的印跡進一步用適當標記的二抗處理，二抗是指一抗的抗體，如一抗是從鼠中獲得的，則二抗是抗鼠Ig G的抗體。處理后，帶有標記的二抗與一抗結合，可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白質的位置。目前有結合各種標記物的抗特定Ig G的抗體可以直接購買作為標記的二抗。最常用的一種是酶連的二抗，印跡用酶連二抗處理后，再用適當的底物溶液處理，當酶純化底物生成有顏色的產物時，就會產生可見的區帶，指示所要研究的蛋白質的位置。在酶連抗體中使用的酶通常是堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶。堿性磷酸酶可以將無色的底物5-溴-4-氯吲哚磷酸鹽(BCIP)轉化為藍色的產物;而辣根過氧化物酶可以以H2O2為底物，將3-氨基-9-乙基咔唑氧化成褐色產物或將4-氯萘酚氧化成藍色產物。另一種檢測辣根過氧化物酶的方法是用增強化學發光法，辣根過氧化物酶在H2O2存在下，氧化化學發光物質魯米諾(luminol，氨基苯二酰一肼)并發光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過將印跡放在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。除了酶連二抗作為指示劑，也可以使用其它指示劑，主要包括以下一些：

　　I125標記的二抗：可以通過放射性自顯影檢測。

　　熒光素異硫氰酸鹽標記的二抗：可以通過在紫外燈下產生熒光來檢測。

　　I125標記金黃色葡萄球菌蛋白A(Protein A)：Protein A可以與Ig G的Fc區特異性的結合，因此Protein A可以代替二抗：I125標記的Protein A通過放射性自顯影檢測。

　　金標記的二抗：二抗通過微小的金顆粒包裹，與一抗結合時可以表現紅色。

　　生物素結合的二抗：印跡用生物素結合的二抗處理后，再用堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的凝集素處理。生物素可以與凝集素緊密結合，這種方法實際上相當于通過生物素與凝集素的緊密結合將二抗與酶連接，通過酶的顯色反應就可以進行檢測。這種方法的優點是由于生物素是一個小分子蛋白，一個抗體上可以結合多個生物素，也就可以結合多個酶連接的凝集素，可以大大增強顯色反應的信號。

　　除了使用抗體或蛋白作為檢測特定蛋白的探針以外，有時也使用其它探針如放射性標記的DNA，可以檢測印跡中的DNA結合蛋白。

　　毛細管電泳

　　毛細管電泳(capillary electrophoresis, CE)又叫高效毛細管電泳(HPCE), 是近年來發展最快的分析方法之一。1981年Jorgenson和Lukacs首先提出在75 內徑毛細管柱內用高電壓進行分離, 創立了現代毛細管電泳。1984年Terabe等建立了膠束毛細管電動力學色譜。1987年Hjerten 建立了毛細管等電聚焦, Cohen和Karger提出了毛細管凝膠電泳。1988～1989年出現了第一批毛細管電泳商品儀器。短短幾年內, 由于CE符合了以生物工程為代表的生命科學各領域中對多肽、蛋白質(包括酶，抗體)、核苷酸乃至脫氧核糖核酸(DNA)的分離分析要求, 得到了迅速的發展。CE是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物。CE和高效液相色譜法(HPLC)相比, 其相同處在于都是高效分離技術, 儀器操作均可自動化, 且二者均有多種不同分離模式。二者之間的差異在于：CE用遷移時間取代HPLC中的保留時間, CE的分析時間通常不超過30min, 比HPLC速度快;對CE而言, 從理論上推得其理論塔板高度和溶質的擴散系數成正比, 對擴散系數小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多;CE所需樣品為nl級, 最低可達270fl, 流動相用量也只需幾毫升, 而HPLC所需樣品為μl級, 流動相則需幾百毫升乃至更多;但CE僅能實現微量制備, 而HPLC可作常量制備。CE和普通電泳相比, 由于其采用高電場, 因此分離速度要快得多;檢測器則除了未能和原子吸收及紅外光譜連接以外, 其它類型檢測器均已和CE實現了連接檢測;一般電泳定量精度差,而CE和HPLC相近;CE操作自動化程度比普通電泳要高得多。總之, CE的優點可概括為三高二少：高靈敏度, 常用紫外檢測器的檢測限可達10-13～10-15mol,激光誘導熒光檢測器則達10-19～10-21mol;高分辨率, 其每米理論塔板數為幾十萬;高者可達幾百萬乃至千萬, 而HPLC一般為幾千到幾萬;高速度, 最快可在60s內完成, 在250s內分離10種蛋白質, 1.7min分離19種陽離子, 3min內分離30種陰離子; 樣品少, 只需nl (10-9 L)級的進樣量;成本低, 只需少量(幾毫升)流動相和價格低廉的毛細管。由于以上優點以及分離生物大分子的能力, 使CE成為近年來發展最迅速的分離分析方法之一。當然CE還是一種正在發展中的技術, 有些理論研究和實際應用正在進行與開發。

　　“CE” 統指以高壓電場為驅動力, 以毛細管為分離通道, 依據樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現分離的一類液相分離技術。(見圖16 毛細管電泳儀器示意圖)。其儀器結構包括一個高壓電源, 一根毛細管, 一個檢測器及兩個供毛細管兩端插入而又可和電源相連的緩沖液貯瓶。在電解質溶液中, 帶電粒子在電場作用下, 以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象叫電泳。CE所用的石英毛細管柱, 在pH>3情況下, 其內表面帶負電, 和溶液接觸時形成了一雙電層。在高電壓作用下, 雙電層中的水合陽離子引起流體整體地朝負極方向移動的現象叫電滲, 粒子在毛細管內電解質中的遷移速度等于電泳和電滲流(EOF)兩種速度的矢量和, 正離子的運動方向和電滲流一致, 故最先流出;中性粒子的電泳流速度為“零”，故其遷移速度相當于電滲流速度;負離子的運動方向和電滲流方向相反, 但因電滲流速度一般都大于電泳流速度, 故它將在中性粒子之后流出, 從而因各種粒子遷移速度不同而實現分離。

　　電滲是CE中推動流體前進的驅動力, 它使整個流體像一個塞子一樣以均勻速度向前運動, 使整個流型呈近似扁平型的“塞式流”。(見圖17 )它使溶質區帶在毛細管內原則上不會擴張。但在HPLC中,采用的壓力驅動方式使柱中流體呈拋物線型, 其中心處速度是平均速度的兩倍, 導致溶質區帶本身擴張, 引起柱效下降, 使其分離效率不如CE。

　　理論分析表明, 增加速度是減少譜帶展寬、提高效率的重要途徑, 增加電場強度可以提高速度。但高場強導致電流增加, 引起毛細管中電解質產生焦耳熱(自熱)。自熱將使流體在徑向產生拋物線型溫度分布, 即管軸中心溫度要比近壁處溫度高。因溶液粘度隨溫度升高呈指數下降, 溫度梯度使介質粘度在徑向產生梯度, 從而影響溶質遷移速度, 使管軸中心的溶質分子要比近管壁的分子遷移得更快, 造成譜帶展寬, 柱效下降。一般來說溫度每提高1℃, 將使淌度增加2% (所謂淌度, 即指溶質在單位時間間隔內和單位電場上移動的距離)。此外, 溫度改變使溶液pH值、粘度等發生變化, 進一步導致電滲流、溶質分子的電荷分布(包括蛋白質的結構)、離子強度等的改變, 造成淌度改變、重復性變差、柱效下降等現象。降低緩沖液濃度可降低電流強度, 使溫差變化減小。高離子強度緩沖液可阻止蛋白質吸附于管壁, 并可產生柱上濃度聚焦效應, 防止峰擴張, 改善峰形。減小管徑在一定程度上緩解了由高電場引起的熱量積聚, 但細管徑使進樣量減少, 造成進樣、檢測等技術上的困難。因此, 加快散熱是減小自熱引起的溫差的重要途徑。液體的導熱系數要比空氣高100倍。現在有的采用液體冷卻方式的毛細管電泳儀可使用離子強度高達 0.5mol/L的緩沖液進行分離, 或使用200 直徑的毛細管進行微量制備, 仍能達到良好的分離效果和重現性。

　　CE現有六種分離模式，分述如下：

　　1. 毛細管區帶電泳(capillary zone electrophoresis, CZE), 又稱毛細管自由電泳, 是CE中最基本、應用最普遍的一種模式。前述基本原理即是CZE的基本原理。

　　2. 膠束電動毛細管色譜 (micellar electrokinetic capillary chromatography, MECC), 是把一些離子型表面活性劑 (如十二烷基硫酸鈉, SDS) 加到緩沖液中, 當其濃度超過臨界濃度后就形成有一疏水內核、外部帶負電的膠束。雖然膠束帶負電, 但一般情況下電滲流的速度仍大于膠束的遷移速度, 故膠束將以較低速度向陰極移動。溶質在水相和膠束相(準固定相)之間產生分配, 中性粒子因其本身疏水性不同, 在二相中分配就有差異, 疏水性強的膠束結合牢, 流出時間長, 最終按中性粒子疏水性不同得以分離。MECC使CE能用于中性物質的分離, 拓寬了CE的應用范圍, 是對CE極大的貢獻。

　　3. 毛細管凝膠電泳 (capillary gel electrophoresis, CGE) 是將板上的凝膠移到毛細管中作支持物進行的電泳。凝膠具有多孔性,起類似分子篩的作用, 溶質按分子大小逐一分離。凝膠粘度大, 能減少溶質的擴散, 所得峰形尖銳, 能達到CE中最高的柱效。常用聚丙烯酰胺在毛細管內交聯制成凝膠柱, 可分離、測定蛋白質和DNA的分子量或堿基數, 但其制備麻煩, 使用壽命短。如采用粘度低的線性聚合物如甲基纖維素代替聚丙烯酰胺, 可形成無凝膠但有篩分作用的無膠篩分(Non-Gel Sieving)介質。它能避免空泡形成, 比凝膠柱制備簡單,壽命長, 但分離能力比凝膠柱略差。CGE和無膠篩分正在發展成第二代DNA序列測定儀, 將在人類基因組織計劃中起重要作用。

　　4. 毛細管等電聚焦 (capillary isoelectric focusing, CIEF) 將普通等電聚焦電泳轉移到毛細管內進行。通過管壁涂層使電滲流減到最小, 以防蛋白質吸附及破壞穩定的聚焦區帶, 再將樣品與兩性電解質混合進樣, 兩端貯瓶分別為酸和堿。加高壓(6～8kV)3～5min后, 毛細管內部建立pH梯度,蛋白質在毛細管中向各自等電點聚焦, 形成明顯的區帶。最后改變檢測器末端貯瓶內的pH值, 使聚焦的蛋白質依次通過檢測器而得以確認。

　　5. 毛細管等速電泳 (capillary isotachor-phoresis,,CITP) 是一種較早的模式, 采用先導電解質和后繼電解質, 使溶質按其電泳淌度不同得以分離, 常用于分離離子型物質, 目前應用不多。

　　6. 毛細管電色譜 (capillary electrochromatography, CEC) 是將HPLC中眾多的固定相微粒填充到毛細管中, 以樣品與固定相之間的相互作用為分離機制, 以電滲流為流動相驅動力的色譜過程, 雖柱效有所下降, 但增加了選擇性。此法有發展前景。

　　毛細管電泳 (CE) 除了比其它色譜分離分析方法具有效率更高、速度更快、樣品和試劑耗量更少、應用面同樣廣泛等優點外, 其儀器結構也比高效液相色譜 (HPLC) 簡單。CE只需高壓直流電源、進樣裝置、毛細管和檢測器。前三個部件均易實現, 困難之處在于檢測器。特別是光學類檢測器, 由于毛細管電泳溶質區帶的超小體積的特性導致光程太短, 而且圓柱形毛細管作為光學表面也不夠理想, 因此對檢測器靈敏度要求相當高。當然在CE中也有利于檢測的因素, 如：在HPLC中, 因稀釋之故,溶質到達檢測器的濃度一般是其進樣端原始濃度的1%, 但在CE中, 經優化實驗條件后, 可使溶質區帶到達檢測器時的濃度和在進樣端開始分離前的濃度相同。而且CE中還可采用堆積等技術使樣品達到柱上濃縮效果, 使初始進樣體積濃縮為原體積的1/10～1%, 這對檢測十分有利。因此從檢測靈敏度的角度來說, HPLC具有良好的濃度靈敏度, 而CE提供了很好的質量靈敏度。總之, 檢測仍是CE中的關鍵問題,有關研究報道很多, 發展也很快。迄今為止, 除了原子吸收光譜、電感耦合等離子體發射光譜(ICP)及紅外光譜未用于CE外, 其它檢測手段如：紫外、熒光、電化學、質譜、激光等類型檢測器均已用于CE。與HPLC類似, CE中應用最廣泛的是紫外/可見檢測器。按檢測方式可分為固定波長或可變波長檢測器和二極管陣列或波長掃描檢測器兩類。前一類檢測器采用濾光片或光柵來選取所需檢測波長, 優點在于結構簡單, 靈敏度比后一類檢測器高;后一類檢測器能提供時間--波長--吸光度的三維圖譜, 優點在于在線紫外光譜可用來定性、鑒別未知物。有些商用儀器的二極管陣列檢測器還可做到在線峰純度檢查, 即在分離過程中便可得知每個峰含有幾種物質;缺點在于靈敏度比前一類略差。采用快速掃描的光柵獲取三維圖譜方式時, 其掃描速度受到機械動作速度的限制。用二極管陣列方式, 掃描速度受到計算機數據存貯容量大小的限制。由于CE的峰寬較窄, 理論上要求能對最窄的峰采集20個左右的數據, 因此要很好地選取掃描頻率, 才能得到理想的結果。