電穿孔和電融合技術

實驗概要

了解細胞電穿孔(electroporation)和電融合(Electrofusion Method)的基本原理。學習電穿孔和電融合基本技術。

實驗原理

當細胞置于非常高的電場中，細胞膜就變得具有通透性，能讓外界的分子擴散進細胞內，這一現象稱為電穿孔。運用這一技術，許多物質，包括DNA、   RNA、蛋白質、藥物、抗體和熒光探針都能載入細胞。作為一種基因轉導方法，電穿孔已被廣泛用于各種細胞類型，包括細菌、酵母、植物和動物細胞；而且，它還能作為注射方法（稱為電注射），把各種外源物質引入活細胞。與其他常用的導入外源物質的方法相比，電穿孔具有很多優點。首先，不必象顯微注射那樣使用玻璃針，不需要技術培訓和昂貴的設備，可以一次對成百萬的細胞進行注射。第二，與用化學物質相比，電穿孔幾乎沒有生物或化學副作用。第三，因為電穿孔是一種物理方法，較少依賴細胞類型，因而應用廣泛。實際上，對大多數細胞類型，用電穿孔法基因的轉移效率比化學方法高得多。

除了能使細胞膜具有通透性，讓外界的分子擴散入胞液中以外，高強度的電場脈沖也能引起細胞融合，這一現象叫做電融合。然而，在用電脈沖融合前必須使細胞相互緊密接觸，這一電融合方法在原生質融合制取雜交植物，胚胎細胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細胞制備單克隆抗體方面用處很大。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規的化學融合方法高10到100倍，最近，貼壁細胞的電融合還被用來研究細胞融合時細胞的骨架成分和細胞器的動力學重排。

主要試劑

1. 穿孔介質（PM）：磷酸鉀 15mmol/L

2. MgCl₂ 1mmol/L

3. 蔗糖（或甘露醇） 250mmol/L　

4. HEPES 10mmol/L　調節pH至7.3

5. 融合介質（FM）：MgCl₂ 1mmol/L

6. 甘露醇 280mmol/LHEPES 2mmol/L　調節pH至7.3

主要設備

1. 脈沖發生器

2. 樣品池（一個盛細胞的容器和兩個平行的金屬電極）

3. CO₂培養箱

4. 顯微鏡

5. 離心機

6. 微量移液器

7. 鑷子

8. 剪刀

9. 手術刀片

10. 三角瓶

11. 吸管

12. 毛細管

13. 離心管

14. 載玻片，蓋玻片

15. NALGEN一次性濾器

實驗材料

外源DNA，對數生長中期細胞

實驗步驟

1. 懸浮細胞的電穿孔法

   1) 電穿孔進行基因轉移

電穿孔可用于將多種不同類型的分子載入活細胞中，操作步驟相似。本實驗中，我們以基因轉移為例。載入其他的分子時，只需把外源DNA換成所需分子即可。

      a. 使細胞在適宜的培養基中生長，用胰酶處理，收獲對數生長中期的細胞，并用腺酶處理。

      b. 在穿孔介質（PM）中至少洗一次。洗細胞時，在臺式離心機上1000rpm離心3分鐘，使得懸浮細胞沉降。然后，去掉上清液，在新的介質中重新懸浮細胞。

      c. 計數細胞，在PM中，濃縮細胞為大約1千萬細胞/ml。

      d. 將DNA加到細胞懸液中，充分混合，使DNA均勻分散，用吸管吸一定體積的細胞-DNA混合液到裝有電極的滅菌小樣品池中。

      e. 在電穿孔裝置上設置輸出電壓和脈沖寬度（脈沖寬度是指數衰減函數的時間常數，即τ=RC，C是電容，R是樣品的電阻）。假如設備是CD脈沖型發生器，設定電容和并聯電阻，以達到合適的τ值。

      f. 將小池放進盛樣品的池中，啟動電穿孔裝置，供給所需的電脈沖。

      g. 電處理后，向小池加1ml普通培養基，將細胞混合液從小池轉移到組織培養容器（培養皿或培養孔）中，再加入一些培養基使最終的培養基體積適量。然后，將樣品細胞放回孵育箱中使之在正常條件下生長。

      h. 在測定轉移基因的表達量前電穿孔細胞各自培養的時間不同。

   2) 檢測電穿孔效率和細胞存活率

      a. 除用羅丹明偶聯葡聚糖（1mg/ml）（分子探針）代替DNA外，將羅丹明偶聯葡聚糖引入目標細胞的方法如前所述。

      b. 電穿孔后，用培養基洗滌細胞兩次，去掉胞外的熒光葡聚糖。

      c. 電穿孔后30min，向細胞懸液中加30μl臺盼藍，孵育2min，然后用培養基洗滌。

      d. 在1000rpm下離心3min，收集細胞，將細胞重懸于PM中，終體積100μl。

      e. 將一滴細胞液（30μl）置于干凈載玻片上，用蓋玻片蓋好，在顯微鏡下檢測細胞，測定攝取熒光標記葡聚糖的百分數。

      f. 在亮視野鏡片下，死細胞可因染成藍色檢測出（攝取了臺盼藍），測定細胞存活的百分數。

      g. 在各種電場設定值下重復實驗，畫出攝取葡聚糖率和細胞存活率對電穿孔參數的曲線。這一曲線就將顯示對特定細胞類型電穿孔的最優條件。

2. 懸浮生長細胞的電融合

融合懸浮細胞的步驟與電穿孔的很類似，只是在進行高強度的電場脈沖前后，必須用低幅、高頻電場使細胞排成一條鏈。

   1) 用融合介質（FM）洗懸浮細胞兩次，然后懸于FM中。洗滌細胞時，在臺式離心機上1000rpm下離心3分鐘，得到細胞沉淀，棄去上清液將細胞懸于新鮮FM介質中。

   2) 將懸浮細胞轉移到相應的融合室內。假如要使兩種不同的細胞彼此融合，轉移前要充分混合。

   3) 啟動介電電泳場，其振幅通常小于200V/cm，頻率在2MHz以內，用顯微鏡檢測細胞是否排成一條鏈，調節振幅和頻率以達到最佳效果。

   4) 讓介電電泳場開約1分鐘后關掉，立即應用融合脈沖，其振幅數量級為1kV/cm。脈沖寬度小于1ms。在進行融合脈沖后立即再次啟動介電電泳場，常規讓其開啟約2分鐘。

   5) 關掉介電電泳場，讓細胞在樣品池中靜置10分鐘。

   6) 去掉FM，用普通培養基再次洗滌細胞。

   7) 將細胞轉移到培養皿，加入普通培養基，在培養箱培養。

注意事項

1. 最優組分依使用的特定細胞種類而有明顯的變化。如果努力優化電壓和脈沖寬度電穿孔結果仍不令人滿意，就應嘗試改變穿孔介質。

2. 影響電穿孔/電融合的另一重要因素與細胞狀態有關，為達到最高效率，必須收集對數生長中期的細胞。