電鏡組織化學技術樣品制備

良好的樣品制備是電鏡酶細胞化學技術成功的關鍵。酶電鏡組織化學 樣品制備要求既要保存酶的活性，同時又要保存細胞的超微結構。并能防止酶反應產物擴散。每種酶對固定液的要求和顯示方法雖不盡相同。但電鏡酶組織化學的基本程序相似，下面簡要介紹其基本要求：

1．取材  組織標本的取材是樣品制備的第一步，非常重要。所以，取材前應做好計劃和充分準備。原則上。目標要明確，操作要迅速。臨床標本取材時還應注意：①活檢鉗的刀口必須鋒利。以免擠壓組織：②取材部位必須是主要病變區；③手術標本除病變部位外，還應分別取病灶與正常組織交界區和遠距病灶區的正常組織作對照。

2．固定  常用的固定劑為2%～4%多聚甲醛和0.5%～2%戊二醛。以0.1mol/LPB或二甲胂酸鈉緩沖液(pH 7.4)配制，固定時間為30―60分鐘(4℃)。注意：固定液的濃度越高，時間越長，越易引起酶失活；對于不同組織和酶，最好通過預實驗選擇合適的固定液濃度和固定時間。

3．漂洗  用與配制固定液相同的緩沖液充分漂洗組織，4℃，1～2小時為宜。

4．切片  組織標本經含蔗糖的緩沖液浸洗3小時以上，用振動切片機或冰凍切片機將組織切成30―50gm厚片，有利于孵育液從切片兩面充分滲透入組織中，與細胞內的酶反應。

5．預孵育  切片經充分漂洗后用不含底物的孵育液預孵10分鐘。

6．孵育  將切片移至含適當底物和捕捉劑的液體孵育，使其發生特異的細胞化學反應。孵育的溫度和時間通常以35℃、30～60分鐘為宜，溫度不宜超過37℃，溫度過高或孵育時間過長，容易導致反應產物的彌散。

注意：為得到較理想的實驗結果．最好通過預實驗確定孵育溫度和時間；應根據實驗需要于用前新鮮配制相應的孵育液；所用試劑純度要高，器皿須清潔；孵育液中底物和捕捉劑的濃度、pH值和緩沖液的緩沖能力等必須配合適當。另外。配制孵育液應按配方順次加入各種試劑，應一種試劑溶解后再加入另一種試劑，最終配制的孵育液應清澈透明，必要時，可過濾除去沉淀后應用。

7．后處理  一般用冷緩沖液漂洗切片終止孵育，繼之用2.5%戊二醛進一步固定，并根據需要可用1%OsO₄，進行適當的后固定(4℃,30～60分鐘)。注意：OsO₄ 固定后，酶反應產物易溶于水，故OsO₄：固定時間以不超過60分鐘為宜。

8．脫水、包埋、超薄切片制作、電子染色以及觀察  按第一節常規電鏡方法進行。但是脫水時間可縮短1/2左右。注意：初次實驗最好不對超薄切片進行電子染色而直接進行電鏡觀察。以了解組織細胞超微結構的保存和反應產物的分布情況，確認電子染色是否影響酶細胞化學反應產物的電鏡觀察。

9．對照實驗  為確保實驗結果的可信性，任何實驗 方法均需必要的對照實驗，酶組織細胞化學技術尤其如此。鑒定酶細胞化學反應特異性的方法較多。主要包括在孵育液中不加底物，或加入酶的特異性抑制劑，或采用熱變性及消化等方法使酶失活，對照實驗應不存在酶反應的沉淀產物。