疏水作用層析

實驗概要

通過實驗了解疏水作用層析的原理與方法。

實驗原理

疏水作用層析（Hydrophobic  Interaction  Chromatography，HIC）是根據分子表面疏水性差別來分離蛋白質和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法。蛋白質和多肽等生物大分子的表面常常暴露著一些疏水性基團，我們把這些疏水性基團稱為疏水補丁，疏水補丁可以與疏水性層析介質發生疏水性相互作用而結合。不同的分子由于疏水性不同，它們與疏水性層析介質之間的疏水性作用力強弱不同，疏水作用層析就是依據這一原理分離純化蛋白質和多肽等生物大分子的。疏水作用層析的基本原理如圖所示。

溶液中高離子強度可以增強蛋白質和多肽等生物大分子與疏水性層析介質之間的疏水作用。利用這個性質，在高離子強度下將待分離的樣品吸附在疏水性層析介質上，然后線性或階段降低離子強度選擇性的將樣品解吸。疏水性弱的物質，在較高離子強度的溶液時被洗脫下來，當離子強度降低時，疏水性強的物質才隨后被洗脫下來。

Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow 是疏水性層析介質的一種，這種層析介質是以交聯瓊脂糖為支持物，交聯瓊脂糖支持物與苯基共價結合。苯基作為疏水性配體，可以與疏水性物質發生疏水作用。Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow結構示意圖如下。

主要試劑

1. 疏水層析介質：Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow

2. 溶液A：0.1M Na₂HPO₄, pH7.0

3. 溶液B：0.1M Na₂HPO₄,pH7.0，1.7M (NH₄)₂SO₄

4. 蛋白質樣品溶于溶液B

主要設備

層析柱（1.6X500px）；恒流泵；梯度混合器；試管及試管架；紫外分光光度計

實驗步驟

1. 層析介質準備：Phenyl-Sepharose^TM 6 Fast Flow疏水層析介質保存在20%乙醇中，取出層析介質后，傾出乙醇溶液。加入溶液A，溶液的體積約占總體積的1/4。

2.  裝柱：將層析柱洗凈，固定在鐵架臺上，層析柱下口用螺旋夾夾緊。加入溶液B，打開下口讓溶液流出，排出殘留氣泡，柱中保留高度約2厘米的溶液。將準備好的層析介質輕輕攪勻，用玻璃棒引流，沿層析柱內壁將層析介質緩慢加進柱中。等到層析介質在柱中沉積高度超過1厘米時，打開下口。柱床高度達到6-8厘米時關閉下口，裝柱盡可能一次裝完，避免出現界面。

3. 柱平衡：用溶液B平衡1-2個床體積。注意始終保持層析介質處于溶液中，不要干柱。

4. 上樣：取樣品加入平衡好的層析柱，并收集層析柱下口流出組分，調節流速為1ml/min,每管3ml。

5. 洗滌：用溶液B洗滌1個床體積，洗去上樣不吸附組分。收集層析柱下口流出成分。

6. 洗脫與收集：梯度混合器左面裝入250ml溶液A，右面裝入250ml溶液B。按照100%-0%1.7M (NH₄)₂SO₄梯度洗脫500ml，收集洗脫液。

7. 檢測：取各收集管樣品，280nm處測定紫外吸收。

8. 疏水層析介質清洗與保存：層析介質先用水清洗，然后用0.5MNaOH洗脫，最后用水洗至中性。處理好的層析介質放在20%乙醇中，4℃保存。

9. 以各個收集管的管號為橫坐標，280nm處紫外吸收值為縱坐標作圖，得到洗脫曲線。分析實驗結果并討論。

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