中和試驗 (neutralization test)是在體外適當條件下孵育病毒與特異性抗體的混合物，使病毒與抗體相互反應，再將混合物接種到敏感的宿主體內，然后測定殘存的病毒感染力的一種方法。凡是能與病毒結合，并使其失去感染力的抗體稱為中和抗體。因為病毒要依賴于活的宿主系統復制增殖，因此，中和試驗必須在敏感的動物體內（包括雞胚）和細胞培養中進行。中和試驗的優點是敏感性和特異性高，中和抗體在體內存在時間長，大多數病毒的中和抗體與免疫力有直接關系。中和試驗的缺點是要使用活的宿主系統，病毒對宿主系統產生作用需要一定的時間，因而出結果慢。
中和試驗的應用很廣泛，主要應用于以下幾個方面：①鑒定病毒；②分析病毒抗原的性質；③測定免疫血清的抗體效價和疫苗接種后的效果；④測定病人血清中的抗體，用于診斷病毒性疾病。來源：《病毒學檢驗》
| 實驗方法原理 | 病毒的復制需要宿主細胞供應原料、能量和復制場所，因此病毒必須在活的細胞內復制增殖。病毒進入機體后，吸附于敏感細胞的表面，然后通過穿入，脫殼，侵入細胞，進行病毒復制和裝配，并引起機體感染。特異性的抗病毒抗體（中和抗體）與病毒結合之后，使病毒失去吸附、穿入宿主細胞的能力，從而阻止了病毒在宿主細胞內的復制和病毒感染機體的過程。進行中和試驗時，首先將病毒與抗體在適當的條件下混合、孵育后，接種給敏感宿主，然后要觀察病毒感染敏感宿主的情況，即觀察殘存的病毒對宿主的感染力。用敏感動物進行中和試驗時，主要觀察抗體能否保護易感動物免于死亡、癱瘓；用細胞培養法進行中和試驗時，主要觀察抗體能否抑制病毒的細胞病變效應 (cytopathic effect, CPE) 或病毒空斑形成等；用雞胚接種法進行中和試驗時，主要通過觀察絨毛尿囊膜上的痘瘡結構來檢測病毒或用血凝試驗檢測雞胚尿囊液流感病毒的滴度。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 病毒抗體陽性的血清和病毒抗體陰性的血清：急性期或恢復期血清（通常 56℃30 min 滅活）敏感宿主體系：敏感細胞、敏感動物、雞胚 |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | （以細胞培養為例）：①用細胞維持液連續倍比稀釋急性期和恢復期血清； ②取1. 0 ml 不同濃度的稀釋血清分別與 1. 0 ml 標準病毒 (100 CCID50/0. 1 m) 混合，置 37℃水浴作用1 h; ③取混合液 0. 2 ml 分別加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養板中，每一稀釋度接種 4孔細胞。同時設 4孔正常細胞對照和設 4 孔 100 CCID50/0. 2 ml 作病毒對照； ④設病毒滴度對照。將病毒液連續 10倍稀釋后，加到細胞已長成單層的 96 孔細胞培養板中，每個稀釋度接種 4孔細胞，每孔加 0. 1 ml。必要時還要設抗體陽性血清對照和抗體陰性血清對照。 ⑤將 96 孔細胞培養板置 37℃、 5% CO2 溫箱中孵育，每日觀察細胞病變效應 (CPE) 。 ⑥50% 血清中和終點的計算： 50% 細胞不產生細胞病變 (CPE) 的血清稀釋度。根據細胞病變程度，用 Reed-Muench 法計算 50%血清中和終點。 |
| 注意事項 | 1. 病毒懸液 病毒應低溫保存，融化后只可使用一次，避免反復凍融，這樣會降低病毒的毒力。多次進行同一試驗時，應使用同一批凍存的病毒，以減小誤差。 2. 抗血清 人和動物血清中含有一些非特異性的物質，這些物質可增強抗病毒抗體的中和作用，也可以滅活病毒，通常采用加熱的方法破壞這些物質。不同來源的血清滅活溫度不盡相同，人、豚鼠血清為 56℃, 兔為 65℃, 時間為 20~30 min。在細胞培養中進行中和試驗時，要注意避免使用相同的細胞。例如，用猴腎細胞培養的病毒免疫動物制備的抗血清，不宜用于以猴腎細胞為敏感宿主的中和試驗上，因為該血清中含有抗猴腎細胞的抗體，對猴腎細胞有細胞毒作用或能封閉猴腎細胞，使病毒不能進入細胞內繁殖，從而影響了中和試驗的結果。 3. 孵育的溫度和時間 病毒與抗血清在 0℃時不發生反應， 5℃以上才發生中和反應。通常采用 37℃ 孵育1 h, 一般的病毒即可和抗血清充分反應。但是，一些特殊的病毒在此反應條件下不能充分反應，試驗時應根據不同的病毒改變孵育的時間和溫度。 |
| 其他 | 該方法主要用于血清抗體滴度的測量。將 100 CCID50/單位體積的病毒分別與連續倍比稀釋的病人急性期或恢復期血清混合孵育 1 h 后，把混合液接種于敏感宿主，然后觀察不同稀釋度的血清保護宿主感染病毒的情況。 |