實驗方法原理 一、病毒的種類
病毒有很多種，常見的有慢病毒和腺病毒
1.1慢病毒
1.1.1原理
慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種。構建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學合成的siRNA 和基于瞬時表達載體構建的普通 siRNA 載體相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經過慢病毒包裝系統包裝后，可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩定表達。
1.1.2特點
1） 直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合 RNAi 研究和體內實驗中難于轉染的細胞 (比如神經元細胞、干細胞或其它原代細胞)。
2） 可以通過簡單方式，在短時間內獲得穩定表達特定基因的多種細胞株。
3） 可用于基因敲除、基因治療和轉基因動物研究。
4） 無需任何轉染試劑，操作簡便。
5） 可以根據客戶需要制備多種標記。
1.1.3慢病毒包裝簡要流程：
1） 含有目的基因的慢病毒 RNAi 干擾載體的構建和質粒純化提取。
2） 慢病毒載體，包裝系統共轉染病毒包裝細胞293T等。
3） 培養 48hrs - 72hrs 左右，收集含有病毒的上清培養液。
4） 病毒的純化和濃縮。
5） 分裝、- 80 ℃保存。
6） 滴度測定目的基因檢定，并出具檢測報告。
1.2、腺病毒
1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一種無包膜的線狀雙鏈DNA病毒，其復制不依賴于宿主細胞的分裂。有近50個血清型，大多數Ad載體都是基于血清型2和5，通過轉基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的復制能力。這些重組病毒僅在高水平表達E1和E3基因的細胞中復制，因此是一種適用于治療的高效控制系統。
1.2.2特點
1） 幾乎可以感染所有類型的細胞
2） 可以獲得復制缺陷型 (E1 和 E3 缺失) 的腺病毒
3） 病毒滴度高，產生病毒經過濃縮后可以達到 1012 PFU/mL，能有效的進行增殖。
4） 腺病毒載體感染宿主的范圍比較廣，制備容易，操作簡單.
5） 感染細胞時，不整合到染色體中，不存在激活致癌基因或插入突變等危險，生物安全性高。
1.2.3腺病毒包裝簡要流程
1） 構建表達 siRNA/miRNA 的腺病毒載體
2） 采用 PacI 消化純化的質粒。
3） 消化好的腺病毒表達載體轉染 293A 細胞，收獲細胞以制備病毒粗提液。
4） 將病毒粗提液感染 293A 細胞以擴增病毒。
5） 分裝，-80℃保存。
實驗材料 大腸桿菌脂質體293T細胞
試劑、試劑盒 細菌培養液LB液體培養基氯化鈣質粒DNABufferS1BufferS2BufferS3DMEM病毒液氯仿TrizolDEPC-水溶解RNA
儀器、耗材 離心機DNA純化柱熒光顯微鏡12孔板離心管
實驗步驟
二、構建目的基因到載體
2.1構建手段
一般是根據原始質粒信息確定克隆方案，有以下兩種手段。
1）如果原始質粒與載體有匹配酶切位點，采用相應的內切酶切下相應片段，回收并連接到載體，酶切，并測序鑒定
2）如果沒有匹配的酶切位點，則設計帶有特殊接頭的引物進行PCR擴增，得到目的片段，采用相應的內切酶切下相應片段，回收并連接到穿梭載體，酶切，并測序鑒定
2.2質粒載體
2.2.1概念
能夠進行自主復制的環狀DNA雙鏈結構，包括真核生物的細胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細菌細胞擬核區以外的環狀脫氧核糖核酸(DNA)分子
2.2.2特征
質粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質粒稱為附加體(episome)，這類質粒能夠整合進真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。質粒在宿主細胞體內外都可復制。通過個些特性，人們可以把一些目的DNA片斷構建在質粒中，通過轉化入大腸桿菌中，利用選擇培養基來篩選從而不斷的復制，來得到目的產物。