痘苗病毒通常采用蔗糖密度梯度離心的方法純化。純化的病毒可用于制備痘苗病毒 DNA ，用于不允許存在感染細胞蛋白污染的研究中，同時也可以用作高滴度的病毒儲液。對于大規模的純化（至少 1 L 的培養物），最好的方法是用 HeLa 細胞懸液作為感染的對象，而不要用單層培養的細胞。
內容來源于《精編分子生物學實驗指南（第五版）》
| 實驗方法原理 | 對于很多研究，部分純化的病毒就足夠了（進行到本實驗步驟 14）， 如果是純化 MVA 病毒，則不能用胰酶消化，也不能用 CEF 細胞或 BHK-21 細胞代替 HeLa 細胞。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | 旋轉搖瓶完全培養基-5帶緊杵的2 L 通氣旋轉搖瓶杜恩斯勻漿器（帶緊杵）杯狀超聲儀Beckman 超速離心機無菌離心管（SW27 或 SW28 轉頭）分光光度計 |
| 實驗步驟 | 1. 使用前將等體積的疸苗病毒儲液和 0.25 mg/ml 的胰酶混合，用力振蕩。37℃ 水浴溫育 30 min，在溫育過程中每隔 5～10 min 渦旋振蕩一次。 2. 用血球計數器對 HeLa S3 細胞計數（附錄 3F）。 3. 將 5 × 108 的 HeLa S3 細胞轉移至離心管中，室溫 1800 g 離心 10 min，棄上清。 4. 然后按 2 × 107 細胞/ml 的濃度用旋轉搖瓶完全培養基-5 重懸細胞。 5. 按 5～8 pfu/細胞（MOI）將消化過的病毒加到細胞懸液中，攪拌溫育 30 min。 6. 將細胞轉移至裝有 1 L 旋轉搖瓶完全培養基-5 的通氣旋轉搖瓶中，攪拌培養 2～3 天。 7. 5～10℃，1800 g 離心 5 min，棄上清。 8. 將細胞懸浮于 14 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中。以下步驟中樣品均需置于冰上。 9. 用杜恩斯勻漿器經過 30～40 次的擊打將細胞懸液均質化，通過顯微鏡檢査細胞的破碎情況。 10. 5～10℃，300 g（H-6000A 轉子中為 900 r/min）離心 5 min 以去除核，保留上清。 11. 將細胞沉淀懸浮于 3 ml 的 10 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液。5～10℃，300 g 離心 5 min，保留上清，并與步驟 10 中的上清合并。 12. 對上清（溶解產物）進行超聲處理，整個過程都應保持溶解產物低溫，按照下面的步驟用杯狀的超聲儀進行超聲。 12.1 將樣品按每份 3 ml 進行分裝，分別超聲處理。 12.2 將杯中裝滿冰水混合物（50％ 的冰），將裝有溶解產物的管子置于冰水混合物 中，用最大功率超聲 1 min。 12.3 重復超聲 3 或 4 次，每次超聲后將溶解產物置于冰上 ≥ 30 s。 13. 將溶解產物加到盛有 17 ml 36％ 蔗糖墊層的無菌 SW27（或 SW28）離心管中。 4℃，32900 g 離心 80 min。將上清吸出丟棄。 14. 將病毒沉淀懸浮于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中。到這一步純化出的病毒對于某些用途，比如分離 DNA，其純度已經足夠了。 15. 按照步驟 12 的方法超聲 1 min。 16. 在使用的前一天制備無菌的 24％～40％ 的持續蔗糖梯度，分別小心地將 6.8 ml 的 40％、36％、32％、28％ 和 24％ 的蔗糖溶液加到無菌的 SW27 離心管中。在冰箱中靜置過夜。 17. 將 1 ml 超聲過的病毒沉淀（來自步驟 15）加到蔗糖梯度的上層。4℃，26000 g 離心 50 min。 18. 可見乳白色的病毒帶出現在離心管的中部。將病毒帶以上的蔗糖溶液吸棄，小心地用無菌槍頭將病毒帶（約 10 ml）收集于一個無菌管中保存。 19. 將剩余的蔗糖溶液吸出后收集聚集于蔗糖梯度底部的病毒聚合物。上下抽吸將病毒沉淀重懸于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ?Cl 溶液中。 20. 按照步驟 12 的方法超聲 1 min。 21. 重復步驟 16～18 的操作，收集病毒帶，與步驟 18 所收集的病毒溶液合并。加入兩 倍體積的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液混合，轉移至無菌的 SW27 離心管中。溶液總體積應有 60 ml，足夠裝滿兩個 SW 27 離心管。如果得到的體積較少，用 1 mol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液補滿離心管。 22. 4℃，32900 g 離心 60 min，吸棄上清。 23. 將病毒沉淀重懸于 1 ml 的 1 mmol/L pH 9.0 的 Tris ? Cl 溶液中，按照步驟 12 的方法超聲，然后按每份 200～250 μl 進行分裝。留一份進行步驟 24 操作，其余的凍存于 -70℃。 24. 用分光光度計在 260 nm 處對未凍存的病毒樣品進行定量，以此確定提取痘苗病毒 DNA 時所需要的病毒量（見輔助方案 2）。 25. 將病毒懸液在冰上超聲 20～30 s（見步驟 12），然后進行 10 倍系列稀釋，直至 10-10。用 10-8、10-9 和 10-10 這 3 個稀釋度去感染 6 孔板中培養的單層生長至匯片 的 BS-C-1 細胞，每個稀釋度做雙份。 |
| 注意事項 | 1. 病毒儲液的滴度通常為 2 × 109 pfu/ml，但不同來源的病毒儲液的滴度也許會遠低于這個滴度。 如果有可見的結團存在，冷卻到 0℃，并在冰上超聲 30 s。超聲可重復數次，但兩次超聲之間樣本應置冰上冷卻。 2. 步驟 12.3 中，因為超聲過程會使冰融化，所以應向杯中重新加入冰。 3. 一個光密度單位是 1.2 × 1010 個病毒顆粒，即是（2.5～5）× 108 pfu。由于光的散射、不吸光，在不同的分光光度計上這個值也許會有輕微的不同。 |