痘苗DNA檢測實驗——斑點雜交法

貼壁生長良好的單層 BS-C-1 或 HuTK-143B 細胞重組病毒噬斑懸液

NaOHTris ? Cl2×SSCPBS胰酶／EDTA干冰／乙醇DNA 提取緩沖液乙酸鈉乙醇PCR 擴增緩沖液引物完全 MEM-10、MEM-2.5 和 MEM-5 培養基完全 MEM-10／BrdU 培養基篩選試劑4 dNTP 混合物MgCl2

硝酸纖維素膜Whatman 3 MM 濾紙80℃ 真空干燥箱24 孔組織培養板杯狀超聲儀

1. 病毒感染細胞并完成篩選（見「PCR 法」步驟 1~9）。

2. 輕輕刮下細胞，轉移到離心管中，最大轉速離心 30 s，棄培養基，用 200 μl PBS 重懸。24 孔培養板中的細胞也可用 1ml 的注射器的活塞刮取。

3. 凍融并超聲細胞懸液（見「PCR 法」步驟 11、12）。

4. 將硝酸纖維素膜剪至適合點跡儀大小，將其用水浸濕，放入儀器中，每孔中加入 20~100 μl 的細胞懸液（步驟 3），用抽吸的方法使液體流過硝酸纖維素膜，隨后將膜取出。

5. 剪 6 片 Whatman 3 MM 濾紙，使其稍大于硝酸纖維素膜，將一塊 Whatman 3 MM 濾紙用 0.5 mol/L NaOH 浸濕。把硝酸纖維素膜放在濕潤的濾紙上 1 min。移開硝酸纖維素膜，將其放在干燥的濾紙上 1 min。用同樣的濾紙重復此步驟 2 次。使用鑷子移開硝酸纖維素膜。

6. 用浸潤過 1 mol/L Tris ? Cl pH 7.5 溶液的濾紙按步驟 5 的方法處理硝酸纖維素膜 （每張膜 3 次）。

7. 用浸潤過 2 × SSC 溶液的濾紙按步驟 5 的方法處理硝酸纖維素膜（每張膜 3 次）。

8. 用 80℃ 真空干燥箱烘烤硝酸纖維素膜 2 h。

9. 進行 DNA 雜交。

1. 所有培養都在加濕的 37℃ 5% CO₂ 培養箱中培養，除非有特殊說明。

2. 與活細胞接觸的器械和試劑都應該是無菌的，操作也必須無菌。