白細胞介素2生物學活性檢測

CTLL　

FCS RPMI16403H-TdRPPOPOPOP二甲苯MTTDMSO

培養板收集儀CO2孵箱計數儀

^一、3H-TdR摻入法

　　　　　　　　
1.  IL-2依賴的CTLL用10 ％FCS RPMI1640洗滌2 次，每次1000 rpm，5 min，除去原培養液中的IL-2

2.  調整活細胞數1×10⁵ /ml

3.  96 孔平底培養板中每孔加100 μl，CTLL懸液（1×10⁴ /孔）

4.  加入不同稀釋度標準IL-2和待測樣品

5.  37 ℃CO2孵箱，培養18～24 h

6.  每孔加³H-TdR 0.5 μci/50 μl，4-6 h

　　　　　　　　　
7.  用細胞收集儀收獲于玻璃纖維紙上

8.  干燥后，移入液閃瓶中，加入1 ml閃爍液，于液閃儀中測β射線的cpm值

9.  計算（舉例）

　　
將標準IL-2不同濃度和待測樣品不同稀釋度時所獲得的cpm值作圖，縱軸采用概率座標（probit），橫座標為Log₂稀釋倍數。從50 ％的最高cpm值畫一橫線，k標準和待檢斜線的交點，即可計算出待檢樣品IL-2的活性單位。

　　
如標準品50 ％最大cpm值時為1 u/ml，則待測標本1∶4時為1 u/ml，原液則為4 μ/ml

二、MTT法
 

MTT（3-（4，5-dimcthylthioazol-2-yl）-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide，四甲基偶氮唑鹽）可作為線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物。當有活細胞存在時，線粒體內琥珀酸脫氫酶可將淡黃色的MTT還原成紫蘭色的甲　（Formazan），將結晶的溶解釋放，可根據所測的OD值反映活細胞的數量和活性，從而推知待檢樣品中IL-2的水平。在掌握良好的實驗條件下，MTT法的敏感性可接近³H-TdR同位素摻入法。

　　　　　　　　
1.  IL-2依賴的CTLL用10 ％FCS RPMI1640洗滌2 次，每次1000 rpm，5 min, 除去原培養液中的IL-2

2.  調整活細胞數1～2×10⁵ /ml

3.  96 孔平底培養板中每孔加100 μl，CTLL懸液（1～2×10⁴ /孔）

4.  加入不同稀釋度標準IL-2和待檢樣品，100 μl/孔，每份設3個重復孔

5.  CO₂孵箱培養18～24 h

6.  每孔加10 μl MTT（5 mg/ml溶于PBS），4 h，37 ℃

　　　　　　　　
7.  輕輕吸出150 μl上清，加入150 μl二甲亞砜（DMSO）或酸性異丙醇（異丙醇溶于0.04 N HCl）

8.  溶解10 min，測OD值（570 nM）

1.  CTLL細胞洗滌要充分，但操作必須輕柔，離心速度不宜過高，否則影響細胞的增殖。

2.  避免同位素污染。

　　
3.  加標準IL-2或待測樣品時，按從低濃度到高濃度順序加。

　　
4.  加入³H-TdR最適時機是陰性對照細胞開始全部死亡。

　　
5.  CTLL細胞凍存后復蘇較困難，用含有絲分裂原條件培養基長期培養容易發生變異。