盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白

原理

盤狀聚丙烯酰胺凝膠，是由丙烯酰胺單體和少量的交聯劑甲叉雙丙烯酰胺，在催化劑的作用下聚合交聯而成的三維網狀結構的凝膠。

改變單體的濃度或單體與交聯劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，將次凝膠灌裝于直立的玻璃管中，再加樣品，進行電泳分離，稱為盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳。一般常采用7.5%的盤狀聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質，2.4%的分離核酸。

盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳又常分為兩大類，第一類是連續的凝膠電泳，第二類是不連續的凝膠電泳

不連續的凝膠電泳亦可稱為盤狀電泳。在這種電泳過程中，除去一般的電荷效應外，還有兩種物理效應：

（1）凝膠對樣品分子的篩選效應：顆粒小，形狀為圓球形的樣品分子，移動較快；顆粒大形狀不規則的樣品分子，通過凝膠孔洞時受到的阻力較大，移動較慢。

（2）不連續系統對樣品的濃縮效應：高度的濃縮效應，大大提高電泳分離的分辨率，特別適用于稀濃度的樣品的分離。

關于不連續系統的濃縮效應，可由兩方面進行分析（以堿性pH緩沖液體系為例）

第一，兩層凝膠孔徑不同。

第二，緩沖液與凝膠的離子成分和pH不同。

本實驗采用不連續系統，堿性緩沖體系，分離血清蛋白質。由于具有電荷效應、分子篩效應、濃縮效應，所以分離效果好，分辨率高。實驗中聚合凝膠時表面覆蓋一層水，是為了防止空氣中的氧氣進入混合液，使聚合作用受抑制，并保證膠面的平整。

步 驟

1 分離膠的制備：TEMED（pH8.9）2mL；分離膠原液 4mL； A.P（0.14%） 10mL（加樣順序不可顛倒）。

2 濃縮膠的制備：TEMED（pH6.7） 1mL；濃縮膠原液 2mL；核黃素（0.1mg／ml），1ml。

3 上槽（略）

4 加樣：BSA、胃蛋白酶各10-20μL，混合樣品30-40μL，豬血清5-10μL，加1/2體積的蔗糖。

5電泳：2mA/管，10-20分鐘后，于3mA/管電泳至溴酚藍指示劑離膠下端0.5cm時，停止電泳。

6剝膠，染色。

7脫色

8繪圖，計算Rf值。