目的基因的獲取4

4、cDNA文庫的大小

一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數目。

p: 文庫包含了完整mRNA的概率（99%）

1/n: 某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例

N：所需的重組載體數（克隆數）
(三)基因組文庫與cDNA文庫的區別

1. cDNA文庫與基因組文庫相比的優越性表現在：

（1）cDNA文庫以mRNA為材料，特別適用于某些RNA病毒，例如流感病毒；因其不通過DNA中間體，所以研究其唯一的方法就是cDNA克隆。

（2）cDNA基因文庫的篩選比較簡單易行。

（3）由于每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，這樣在目的基因的選擇中出現假陽性的概率比較低，而相比之下基因組文庫克隆的選擇較復雜，假陽性的概率就高。

（4）cDNA克隆可用于在細菌中能進行表達的基因克隆，直接應用于基因工程操作。

原因是：高等真核生物與原核生物在結構組成上的最大區別是前者含有內含子間隔序列，而后者沒有。通過基因文庫中篩選的目的基因難以在原核生物中表達。而cDNA是經過轉錄后得來的其內含子部分已被刪除。

（5）cDNA克隆還可以用于真核細胞mRNA的結構和功能的研究

種特異的mRNA在細胞中往往占很小的比例，難以直接研究其序列、結構和功能。一般是通過比較基因組進行確定

2. cDNA文庫與基因組文庫相比的缺點

（1）受材料來源的影響：

（2）遺傳信息量有限：

①文庫構建時的信息供體是某一時空條件下的細胞總mRNA，它是在轉錄水平上反映該植物在某一特定發育時期，某一特定組織（或器官）在某種環境條件下的基因表達情況，并不能包括該植物有機體的全部基因。在某種意義上講它可以表現基因組的功能信息。

②cDNA文庫只反映mRNA的分子結構。cDNA中不含有真核基因的間隔序列及調控區，確切說cDNA并不是真正意義上的基因。

（3）構建的cDNA文庫中高豐度的（含量） mRNA含量比低豐度的易得和分離，其實現在構建的cDNA基本上是高豐度的而低豐度的很少

(四)克隆的鑒定方法

要鑒定DNA文庫中的一個特殊克隆，可以通過克隆的序列和其表達產物的結構功能來進行的。前者可用于任何類型的文庫、基因組或cDNA，它包括核酸雜交和PCR。無論哪種情況，探針或引物的設計都可用于一個特殊的克隆或者一系列結構相關的克隆。注意，PCR篩選也可用于從未克隆的基因組DNA和cDNA中分離DNA序列。對克隆產物的篩選僅用于表達文庫，例如DNA片段可用于表達一個蛋白質的文庫。在此情況下，克隆可得到鑒定，因為其產物可由一些自然的抗體或配基來確定，或者因為保持了蛋白質的生物活性，而可由適當的檢驗系統來檢測。

篩選目的克隆最常用的方法是探針雜交法。

探針是由目的基因的已知的信息決定的，有三種可能性：

1） 目的基因在特定細胞中的豐度

2） 基因所編碼的蛋白質或者部分序列

3） 基因是一個基因家族中的一個

舉例： 利用同源探針篩選目的克隆

任意的兩條單鏈核酸分子都有可能通過堿基配對結合，大部分的配對分子是不穩定的，因為只有少量的堿基配對。然而如果兩條鏈是互補的，大部分堿基可以配對形成穩定的分子。不僅DNA間可以配對，DNA 與RNA間也可以進行配對。因此可以使用同源探針篩選目的克隆。

如果克隆的基因所編碼的蛋白已知。就可以利用遺傳密碼子預測相關基因的核苷酸序列，只有蛋氨酸和色氨酸無兼并密碼，其他的氨基酸至少有兩種密碼子。例如丙氨酸有四種密碼子，前兩位是相同的，GCA,GCT,GCC,GCG，只能正確的預測兩位的堿基。
例如細胞色素C，從59號氨基酸的一段序列：Trp-Asp-Glu-Asn-Asn-Met，相應的DNA序列是TGG-GA(T/C)-GA(A/G)-AA(T/C)-AA(T/C)-ATG，在18個堿基中有14個是可以預測的。如果用來雜交的18核苷酸的序列有上千種可能的排列，很顯然不適合于合成探針。
利用同源探針克隆基因

第四節 化學合成

1976年H.G. Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，并于1979年在science上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸tRNA基因的論文。化學法主要適用于已知核苷酸序列的、分子量較小的目的基因的制備。在基因的化學合成中，通常是先合成一定長度的、具有特定序列的寡核苷酸片段。寡核苷酸片段的化學合成方法主要有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法，以及在后者基礎上發展起來的固相合成法和自動化法。其中，全自動合成儀化學合成DNA采用效率極高的是固相亞磷酸三酯法。

固相亞磷酸三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA的合成，其合成方向是由引物的3′末端向5′端合成，相鄰核苷酸通過3′—5′端磷酸二酯鍵連接。其過程為：（1）將預先連接在固相載體上的活性基團被保護的核苷酸與三氯乙酸反應，脫去其5′-羥基的保護基團DMT，獲得游離的5′-羥基；（2）合成DNA的原料（亞磷酰胺保護的核苷酸單體）與活化劑四氮唑混合，得到反應活性很高的核苷亞磷酸活化中間體（其3′端被活化，5′-羥基的仍然被DMT保護），與溶液中游離的5′-羥基發生縮合反應；（3）帶帽反應，縮合反應中可能極少數5′-羥基沒有參加反應，帶帽反應中使用乙酸酐和1-甲基咪唑使這些核苷5′-羥基反應形成酰，終止其繼續發生反應而成為短片段，這種短片段在純化時分離掉；（3）縮合后在氧化劑碘的作用下，亞磷酰形式轉變為更穩定的磷酸三酯。經過以上四個步驟，一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。

目前，化學合成寡聚核苷酸片段的能力一般局限于150-200bp，而絕大多數基因的大小超過了這個范圍，因此，需要將寡核苷酸適當連接組裝成完整的基因。

常用的基因組裝方法主要有兩種：

第一種方法是將寡聚核苷酸激活，帶上必要的5’-磷酸基團，然后與相應的互補寡核苷酸片段退火，形成帶有粘性末端的雙鏈寡核苷酸片段，再用T4DNA連接酶將它們彼此連接成一個完整的基團或基團的一個大片段。

第二種方法是將兩條具有互補3’末端的長的寡核苷酸片段彼此退火，所產生的單鏈DNA作為模板在大腸桿菌DNA聚合酶Klenow片段作用下，合成出相應的互補鏈，所形成的雙鏈DNA片段，可經處理插入適當的載體上。