| 實驗方法原理 | 實驗要經過兩次連續大量的酵母菌平板篩選過程。酵母菌含有 LexA 融合探針、報道基因和插入PJG4-5（見圖19.1.6）的 GAL 啟動子控制下的 cDNA 表達文庫。最近，已有可供用于這個系統的文庫。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | 30℃ 培養箱低速離心機和轉子50 ml 錐形試管無菌 1.5 ml 微量離心管無菌 42℃ 加熱板無菌玻璃顯微鏡載玻片 |
| 實驗步驟 | 實驗材料、試劑的準備請見「其他」。 1. 將約 20 ml 含 LexA-操縱子-lacZ 表達質粒和 pBait 的酵母菌 EGY 48 或 EGY 191 培養液接種到 Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液體培養基中，于 30℃ 培養過夜。 2. 將培養液稀釋到 300 ml Glu/CM-Ura、-His 缺失成分液體培養基中至濃度約為 2×106 細胞/ml（OD600 約 0. 10），于 30℃ 培養直至培養液密度約為 1 × 107 細胞/ml（OD600 約 0. 50）。 3. 室溫下以 1000~1500 g 在低速離心機中離心 5 min，收集酵母菌細胞。菌體重懸在 30 ml 無菌水中，并移至 50 ml 錐形離心管中。 4. 以 1000~1500 g 離心 5 min，棄上清，菌體用 1.5 ml TE/0.1 mol/L 乙酸鋰重懸。 5. 取 30 個微量離心管分別加 1 μg 的插入文庫 DNA 的 pJG4-5 質粒和 50 μg 高純度的剪切均勻的鮭精載體 DNA，然后分別加入 50μl 從步驟 4 獲得的重懸酵母菌液。 加入的文庫和鮭精 DNA 的總體積應小于 20μl，最好小于 10μl。一個典型的文庫轉化將獲得 2~ 3 ×106 個原代轉化子。這一轉化總共需要 20~30 μg 文庫 DNA 和 1~2 mg 載體 DNA。 6. 分別加入 300 μl 40% pEG 4000/0.1 mol/L 乙酸鋰/TE 緩沖液，pH 7.5，顛倒混合直至完全混勻，于 30℃ 溫育 30 min。 7. 加入 DMSO 至終濃度 10%（每管約 40 μl），顛倒混勻，在 42℃ 加熱板上熱激 10 min。 8.1 取其中 28 管：每管涂布一塊 24 cm×24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基平板，于 30℃ 培養。 8.2 剩余的 2 管：每管取 360μl 涂布在 24 cm × 24 cm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基平板上。剩余的 40 μl 用無菌水作 1 : 10 的分別等比稀釋，再取稀釋液 分別涂布在 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基平板上，將所有平板置于 30℃ 培養 2~3 天直至菌落出現。 系列稀釋將給出一個大約轉化的效率，由此可估算所獲轉化子的值。 9. 將所有生長轉化子的 24 cm×24 cm 平板在 4℃ 下冷卻數小時，使瓊脂變硬。 10. 戴上手套，使用無菌玻璃顯微鏡載玻片，輕輕地從平板上將酵母菌細胞刮下來。將 30 個平板上刮下來的細胞收集到 1 或 2 支 50 ml 無菌的錐形試管中。 11. 用 1 體積或至少與轉移細胞體積相等的無菌 TE 緩沖液或水洗滌細胞，室溫下以 1000~1500 g 離心 5 min，棄上清后重復洗滌 1 次。 12. 用 1 體積的甘油溶液重懸沉淀的酵母菌細胞，混勻后分裝成每份 1 ml，于 -70℃ 可保存 1 年。 13. 復活酵母細胞時，用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基將一份凍存的轉化酵母細胞作 10 倍稀釋，于 30℃ 搖床溫育 4 h，誘導文庫上的 GAL 啟動子。 14. 接著用 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基系列稀釋酵母菌細胞。涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基平板上，于 30℃ 培養 2~3 天至長出可見的菌落。 15. 計算菌落數，推算出每一等份被轉化的酵母菌的菌落形成單位（cfu）數。 16. 基于鋪板效率解凍適當數量的轉化酵母菌，按照步驟 13 稀釋，培養。為了獲得 107 細胞/ml 的濃度（OD600 約等于 0.5），按需要將轉化酵母菌培養液稀釋到 Gal/ Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培養液中。按總轉化子數計算所需的平板數，并以每平板 100 μl 涂布在 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺 失成分培養基平板上。于 30℃ 培養 2~3 天直至菌落出現。 17. 小心地挑取適當的菌落接種到一個新鮮的 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培養基主平板上，于 30℃ 培養 2~7 天至菌落出現。 挑出在第 2 天長出的菌落接種到一個主平板上，第 3 天長出的菌落接種到一個第二主平板上，而 第 4 天長出的菌落接種到一個第三主平板上。如果獲得了許多明顯的陽性菌落，那么用在第 4 天（及以后數天）可能獲得更大數目的菌落制備主平板。 18. 再從 Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 缺失成分培養基主平板上挑菌落轉至 100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基主平板上，于 30℃ 過夜培養至菌落形成。 19. 從這個主平板上挑菌劃線或影印在以下平板上： Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 這個時候，如果菌落在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈藍色但在 Glu/X-gal 平板上不變藍或僅呈很弱的藍色，并且菌落在 Gal/Raff/CM-Leu 平板上生長而不能在 Glu/CM-Leu 平板上生長，那么所獲得的菌落和文庫質粒可暫定為陽性。 以下步驟用以測定 Leu +插入的 Gal 依賴和 lacZ 表型來證實這是因為文庫編碼蛋白表達的結果。在誘導之前關閉了 GAL1 啟動子并排除了 -Leu 選擇。 20.1 按直接電穿孔方案將酵母菌質粒直接轉移到 E.coli 中，接步驟 22。 20.2 通過快速小量制備方案從酵母菌中分離質粒 DNA，并作以下修改：獲得水相后，加入乙酸鈉（NaAc）至終濃度 0.3 mol/L 和 2 體積的無水乙醇，置冰浴 20 min，以最大速度微量離心 15 min，用 70% 乙醇洗滌沉淀，干燥后用 5 μl TE 緩沖液溶解沉淀。 21. 用 1 μl DNA 電穿孔到 KC 8 細菌中，放置在 LB/氨芐平板上，37℃ 過夜。 22. 劃線或復制 LB/氨芐平板上的克隆到細菌確定的極限 A 培養基平板含有維生素 B1 和 Ura、His、Leu，而無 Trp。37℃ 過夜。 23. 用細菌小量制備方案純化文庫質粒。這個階段不要對獲得的 DNA 測序，因為可能分離到的克隆沒有相互作用。在完成特異試驗后再測序。 因為多種 2 μm 帶有相同標志質粒可以在酵母中同時存在，一個單獨的酵母有時含有兩個或更多不同的文庫質粒，而只有其中的一種編碼相互作用蛋白。對于每一種酵母菌陽性克隆應至少排選 兩個單獨的細菌轉化子，采用 EfoRI 和 Xhol 消化產生 cDNA 插入片段，并進行瓊脂糖微膠電泳來驗證兩個質粒是否含有相同的插入片段。 24. 在不同的轉化實驗中，用從步驟 23 純化的質粒轉化已含有下列質粒并生長在 Glu/ CM-Ura、-His 平板上的酵母菌： 含 pSH18-34 和 pBait 的 EGY48 含 pSH18-34 和 pRFHM-1 的 EGY48 含 pSH18-34 和非特異性誘餌蛋白質粒的 EGY48（可選） 25. 將每一種轉化混合物涂布在 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基平板上，于 30℃ 培養 2 到 3 天直到菌落長出。 26. 對每個待驗證的文庫質粒均涂布一個 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 缺失成分培養基的主平板。即從每個轉化平板上挑 5 或 6 個單獨的菌落接種到 Glu/CM-Ura、-His、-Trp 平板上，于 30℃ 過夜培養。 27. 從這種缺失成分主平板上挑菌或影印菌落至實際篩選中所用的同一系列的驗證平板上： Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu 一旦細胞中含有 LexA 誘餌蛋白，真正的陽性 cDNA 應使細胞在 Gal/Raff/X-gal 平板上呈藍色但在 Glu/X-gal 平板上不變藍，而且應能使細胞在 Gal/Raff/CM-Leu 缺失成分平板上生長但不能在 Glu/CM-Leu 缺失成分平板上生長。符合這種標準的 cDNA 即可進行測序（見圖 19.1.3 說明中的引物序列）或進行特性分析。那些編碼與 RPHF-1 或另一種非特異性的誘餌蛋白相互作用蛋白的 cDNA 應該丟棄。 從 cDNA 數據庫中對照查詢被認為是假陽性的分離 cDNA 也許是有益的。 28. 如果條件合適，可進行另外的特異性驗證實驗。對陽性分離子進行分析并測序。 用于 PJG4-5 的引物序列在圖 19.1.4 中圖注中列出。從 KC8 制備的 DNA 即使在用 Qiagen 柱或氯化銫梯度純化后一般仍不適于進行雙脫氧或自動測序。待測序的文庫質粒在測序前應該用從 KC8 小量制備的質粒轉化一種更適于測序的菌株，如 DH 5a。 |
| 注意事項 | 1. 所有溶液和與細胞接觸的儀器都必須是無菌的，而且操作時應采用適當的無菌技術。 2. 加入的文庫和鮭精 DNA 的總體積應小于 20μl，最好小于 10μl。一個典型的文庫轉化將獲得 2~ 3 ×106 個原代轉化子。這一轉化總共需要 20~30 μg 文庫 DNA 和 1~2 mg 載體 DNA。 |
| 其他 | 攜帶適當質粒組合（見表 19.1.1 和表 19.1.2）的酵母菌： 含 LexA-操縱子-lacZ 報道質粒和 pBait 的 EGY48 含 LexA-操縱子-lacZ 報道質粒和 pRFHM-1 的 EGY48 含 LexA-操縱子-lacZ 報道質粒和任一非特異性誘餌蛋白質粒的 EGY48 完全（CM）缺失成分液體培養基，含有如下指示劑的糖 [葡萄糖、半乳糖和（或）棉籽糖][2% (m/V) Glu 或 2% (m/V) Gal + 1% (m/V) Raff（棉籽糖）]： Glu/CM-Ura、-His Glu/CM-Trp Gal/Raff/CM -Ura, -His、-Trp 無菌水 TE 緩沖液（pH 7.5）/0.1 mol/L 乙酸鋰 克隆于 PJG4-5 質粒的文庫 DNA（見表 19.1.3，圖 19.1.6） 高純度剪切均勻的鮭精 DNA 40% (TTI/V) PEG 4000（過濾除菌）/0.1 mol/L 乙酸鋰/TE 緩沖液（pH 7.5） 二甲基亞砜（DMSO） 完全（CM）缺失成分培養基平板，含有如下指示的（20 mg/ml）X-gal 和糖 [2% (m/V) Glu， 2% (m/V) Gal+1 % (m/V) Raff（棉籽糖）]： Glu/CM-Ura、-His、-Trp，24 cm × 24 cm（Nunc）和 100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp，100 mm Gal/Raff/CM-Ura、-His、-Trp、 -Leu，100 mm Glu/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp，100 mm Gal/Raff/X-gal/CM-Ura、-His、-Trp，100 mm Glu/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu，100 mm Glu/CM-Ura、-His，100mm Gal/CM-Ura、-His、-Trp、-Leu，100mm TE 緩沖液，pH 7.5 無菌（選用） 甘油溶液 E.coli KC 8 株 E.coli DH 5a 或其他可用于制備供測序用 DNA 的株系 LB/氨芐青霉素平板 細菌確定的極限 A 培養基平板：1×A 平板添加 0.5 μg/ml 維生素 B1，再分別添加 40 μg/ml Ura、His 和 Leu |