真核細胞表達系統2

在病毒感染晚期，由于大量外源蛋白的表達引起昆蟲細胞的裂解，胞質內的物質釋放出來，與 目的蛋白混在一起，從而使蛋白的純化工作變得很困難，另外水解酶的釋放會降解重組蛋白。為了克服以上這些困難，科學工作者先后嘗試用絲蛾肌動蛋白基因啟動子或桿狀病毒ie-1基因啟動子表達外源蛋白，但效果都不明顯。Farrel等介紹了一種新型的鱗翅目昆蟲細胞表達系統，該系統主要包括3個調節外源蛋白表達序列：

（1）Bombyx mori的肌動蛋白基因啟動子；

（2）Bombyx mori的核型多角體病毒(BmNPV)的立早基因ie-1(編碼俄IE-1蛋白，該蛋白是種轉錄激活因子，可在體外激活肌動蛋白基因啟動子)；

（3）BmNPV的同源重復序列3(HR3)可作為肌動蛋白基因啟動子的增強子。

三者協同作用，可使轉錄活性提高 1000倍以上，從而大大地提高外源蛋白的表達水平。另外目前還有一種新型的宿主范圍廣的雜合核多角體病毒(HyNPV)被應用于昆蟲細胞表達系統的構建，該病毒由AcNPV及 Bni'qP發展而來。

一般情況下桿狀病毒表達系統所能表達的外源蛋白只有少部分是分泌性的，大部分為非分泌性。為了解決這個問題將Hsp70(熱休克蛋白70)與外源蛋白共表達可明顯提高重組蛋白的分泌水平，這是因為分泌性多肽被翻譯后必須到達內質網進行加工才能被分泌至胞外。如果到達內質網前，前體多肽就伸展開來，暴露出疏水殘基，殘基間的相互作用可引起多肽的凝聚，這對最終的表達水平有很大影響。而Hsp70是一種分子伴侶，能夠與新翻譯的多肽結合，抑制前體肽的凝聚使前體肽順利到達內質網進行加工，從而提高蛋白的分泌水平。

最近，人們又構建了桿狀病毒-S2表達系統，該系統能將重組桿狀病毒轉染果蠅S2細胞，以前人們認為桿狀病毒僅能在鱗翅目昆蟲細胞(如 sf9、sf21)中復制，不能在其他昆蟲細胞(如果蠅細胞)中復制，然而目前研究表明在一定條件下，桿狀病毒也能感染果蠅細胞。在果蠅細胞中，桿狀病毒的多角體基因啟動子幾乎不發生作用。桿狀病毒-S2表達系統的表達載體利用的是果蠅啟動子如Hsp70啟動子、肌動蛋白5C啟動子、金屬硫蛋白基因啟動子等，其中，Hsp70啟動子的作用最強。重組桿狀病毒感染S2細胞后不會引起宿主細胞的裂解，且蛋白表達水平與鱗翅目細胞相似，因此，桿狀病毒-S2系統是一個很有應用前景的昆蟲細胞表達系統。昆蟲細胞表達系統，特別是桿狀病毒表達系統由于其操作安全，表達量高，目前與酵母表達系統一樣被廣泛應用于基因工程的各個領域中。

3、哺乳動物細胞表達系統 由哺乳動物細胞翻譯后再加工修飾產生的外源蛋白質，在活性方面遠勝于原核表達系統及酵母、昆蟲細胞等真核表達系統，更接近于天然蛋白質。哺乳動物細胞表達載體包含原核序列、啟動子、增強子、選擇標記基因、終止子和多聚核苷酸信號等。

將外源基因導入哺乳動物細胞主要通過2類方法 ：一是感染性病毒顆粒感染宿主細胞，二是通過脂質體法、顯微注射法 、磷酸鈣共沉淀法及DEAE一葡聚糖法等非病毒載體的方式將基因導入到細胞中。外源基因的體外表達一般采用質粒表達載體，如將重組質粒導入CHO細胞可建立高效穩定的表達系統，而利用COS細胞可建立瞬時表達系統。目前，病毒載體已成為動物體內表達外源基因的有力工具，在臨床基因治療的探索中也發揮了重要作用。痘苗病毒由于其基因的分子量相當大(約187kb)，利用它作為載體可同時插入幾種外源基因，從 而構 建多價疫苗。另外，逆轉錄病毒感染效率高，某些難轉染的細胞系也可通過其導入外源基因，但要注意的是逆轉錄病毒可整合入宿主細胞染色體，具有潛在的危險性。