石蠟切片或細胞的原位雜交實驗

實驗材料 石蠟切片

試劑、試劑盒 HCl二甲苯乙醇SSCPBS鏈霉蛋白酶甘氨酸DTTRNA酶消化液乙酸銨

儀器、耗材 染色盤加濕盒載玻片烘箱水浴鍋培養箱

實驗步驟

1.  準備脫蠟/再水化系統（可重復使用數次）及0.2 mol/l HCl同時，將載有切片樣品的載玻片（玻片盒中，于-20℃或-70℃貯存）置室溫。開始預熱2×SSC至70℃（步驟5中使用）。

2.  在加有二甲苯的染色盤中進行切片脫蠟，更換二甲苯3次，毎次同隔2 min（對載有未經包埋單細胞的玻片則無必要）。 

3.  通過如下各組染色盤進行再水化。100%乙醇2次，每次2 min；95%乙醇2 min；70%乙醇2 min，50%乙醇2 min。 

4.  樣品室溫下于0.2 mol/l HCl中變性20 min。

5.  樣品在70℃ 2×SSC中熱變性15 min，浸于1×PBS，2 min。

6.  在新配制的4%PFA固定液中進行樣品后固定，置室溫5 min。于3×PBS中終止固定3 min，繼以1×PBS浸2次，每次30 s。

7.  在含10 mmol/l DTT的1×PBS中平衡樣品，置45℃水溶10 min。

8.  以新配制的封阻液進行封閉。置45℃水浴30 min，水浴時用鋁箔覆蓋（碘乙酰胺對光敏感）。

9.  室溫下，以1×PBS浸洗2次，每次2 min。

10.  于新配制的TEA緩沖液中，平衡樣品2 min，移玻片架于新的TEA緩沖液中，并加 乙酸酐至0.25%終濃度。快速混合，并在攪拌情況下，浸泡玻片5 min。再加乙酸酐至0.5%終濃度，再浸泡5 min。

11.  樣品移至2×SSC中浸泡5 min。

12.  分別以50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇和100%乙醇（2次）浸泡進行樣品脫水。室溫下，每次2 min（用步驟3乙醇溶液）。

13.  空氣干燥樣品（或于干燥器中干燥）繼續實驗前應確證樣品絕對干燥，樣品放在加有干燥劑的玻片盒中，于-70℃干貯過夜。

14.  離心乙醇沆淀的反鏈及正鏈35S標記的核酸探針以及S-核糖核酸探針競爭物。沉淀干后，以5 μl 無菌的5 mmol/l DTT溶解沉淀。加2.5 μl（反應的半量）S-核糖核酸探針競爭劑于反鏈及正鏈核糖核酸探計中。

15.  100℃加熱3 min，使探針變性。

16.  立即加足量雜交液A，使探針終濃度為0.3 μg/ml，充分混合。測定放射活性（期望放射活性計數值≥1×105 cpm/μl）。將管置 45℃水浴（雜交溫度）。

17.  小心在標本上鋪加適量探針（如用加樣吸頭，按20 μl/20 mm3 鋪加，開始雜交）。

18.  置樣品于加濕盒中（載玻片水平放置），加濕盒內加入加濕盒溶液A，于 45℃溫育雜交適當時間。雜交時間可進行30 min~4 h（須平衡濕盒內液體并小心密封濕盒，因為如果樣品干了，將導致高雜交本底出現，加濕盒溶液與雜交混合液的滲透壓必須相同，以防止雜交液稀釋或濃縮）。

19.  雜交過程最后一小時期間，準備并預熱洗液A、B、C。

20.  開始洗玻片，將載玻片浸入55 ℃ 100 ml 洗液A中，立即放入玻片架并放入盛有溶液A的染色盤中。

21.  在55℃溶液A中洗2次，每次15 min 繼續在55℃溶液B中洗2次，每次15 min。然后，室溫下，以溶液C洗2次，每次2 min。

圖一、雜交混合物在載玻片上的應用

22.  每一玻片上加500 μl RNA酶消化液，覆蓋樣品全部，將玻片放入加濕盒中（盛有水），標明RNA酶專用。室溫放置15 min。

23.  在50℃洗液C中，緩慢振搖洗玻片2次，每次30 min。再于50℃洗液A中，緩慢搖洗玻片2次，每次30 min 繼續在室溫下，以2×SSC洗玻片2次，毎次5 min。

24.  經以下各組液體中（毎次2 min）進行脫水處理：50%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸銨、70%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸銨、90%乙醇 / 0.3 mol/l 乙酸銨、100%乙醇。

25.  空氣中干燥載玻片。壓膠片曝光至少過夜，然后進行乳膠放射自顯影。

注意事項

1.  以上所有步驟均是將承有樣品的載玻片置于玻片架中，并在盛有指定溶液的玻璃染色盤中進行，除非另有說明，所有溶液均為新配制，并只使用一次。

2.  碘乙酰胺和N-乙基馬來酰亞胺為劇毒物，應小心操作。