⑴一抗和二抗濃度不合適或孵育條件不妥。
⑵熒光素提前衰退。熒光素質量不佳或操作過程中沒有注意避光等防止熒光素衰退的事項。
⑶血清封閉時間過長。
⑷抗體稀釋液PH值不合適，影響抗原抗體反應。
⑸組織切片不平、裂片或脫片很嚴重，易引起大塊陰性著色。
⑹組織標本不新鮮或已經冷凍組織制成的切片中抗原易彌散，易引起本來表達的部位陰性染色或弱著色。
⑺熒光顯微鏡不會使用，激發波長選擇錯誤。
