石蠟包埋組織樣本的制備

組織胰蛋白酶

二甲苯乙醇生理鹽水

尼龍網

1. 把石蠟包埋組織切成 40~50 μm 厚的組織片 3~5 片，或用乳缽研成 0.5 mm 直徑大小顆粒狀，放入 10 ml 的試管中。

2. 加入二甲苯 5~8 ml 時，在室溫下脫蠟 1~2 d，視石蠟脫凈與否，更換 1~2 次二甲苯，石蠟脫凈后，棄去二甲苯。

3. 水化：依次加入 100%、95%、70%、50% 梯度乙醇 5 ml，每步為 10 min，去乙醇，加入蒸餾水 3~5 ml，10 min 后棄之。

4. 消化：加入 2 ml 0.5% 胰蛋白酶 ( pH 1.5~2.0) 消化液，置 37℃ 恒溫水浴中消化 30 min，在消化期間，每隔 10 min 用振蕩器振蕩 1 次。

5. 消化 30 min 后，立即加生理鹽水終止消化。

6. 經 300 目尼龍網過濾，未消化好的組織可做第 2 次消化。

7. 收集細胞懸液，離心沉淀 1500 r/min，再以生理鹽水漂洗 1~2 次，離心沉淀 500~800 r/min，去碎片。

8. 保存細胞備用。

1. 一定要將石蠟從組織中脫干凈，一般脫蠟第 1 遍應在 12 h 左右，第 2 遍為 30 min 左右。檢測是否將石蠟已脫凈的方法是棄去二甲苯，加入無水乙醇，如果無絮狀物浮起，即可視為蠟己脫凈；反之，則蠟尚未脫凈。

2. 消化時間不可過長，以免造成已釋放出的細胞核被消化。

3. 切片不可過薄或過厚，過薄細胞碎片過多，影響分析結果；過厚造成脫蠟不理想。

4. 消化后的組織應先用眼科剪刀剪碎，然后再加胃蛋白酶消化，30 min，37℃，然后用尖吸管吹打成懸液狀。

5. 消化后的組織懸液經過過濾后可能細胞數很少，這樣就要將組織片放在 300 目尼龍網上，用底部圓滑的試管磨碎，再用 PBS 液沖洗一下；如此反復，就能得到較多的單細胞懸液。