研究蛋白質RNA相互作用的新工具

　　近日，賽默飛世爾科技全新推出了一款Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，讓研究人員能夠以末端標記的RNA作為誘餌，輕松富集蛋白質-RNA的相互作用。與抗體捕獲相比，這種方法的優勢在于脫硫生物素化的目標RNA能夠直接富集RBP(或復合物)。

　　蛋白質與RNA的相互作用是許多細胞功能的核心，如蛋白質合成、mRNA組裝、病毒復制、細胞發育調控等。了解它們之間相互作用的分子機制對理解這些生物學過程非常重要。然而，之前的分析方法往往受限于使用放射性標記，或實驗步驟過多，不僅耗時費力，也增加了實驗結果的不穩定。

　　近日，賽默飛世爾科技全新推出了一款Pierce Magnetic RNA-Protein Pull-Down Kit，讓研究人員能夠以末端標記的RNA作為誘餌，輕松富集蛋白質-RNA的相互作用。

　　此試劑盒利用脫硫生物素末端標記的RNA和鏈霉親和素磁珠標記的來高效富集RNA結合蛋白(RBP)。與抗體捕獲相比，這種方法的優勢在于脫硫生物素化的目標RNA能夠直接富集RBP(或復合物)。此外，試劑盒還提供了經過驗證的對照，適用于標記和pull-down分析，也與多個下游應用兼容，如Western blotting和質譜(MS)。

　　試劑盒中包含了Pierce RNA 3’-End Desthiobiotinylation Kit。它利用T4 RNA連接酶將單個脫硫生物素化的胞苷二磷酸連接到單鏈RNA的3’端。3’端的末端標記不干擾RNA結構，因此，比標記核苷酸的隨機摻入更加理想。每個標記反應適合50 pmol RNA;不過，如有必要的話，標記反應也可擴展(從1 pmol到1 nmol)。標記反應需要20倍過量的脫硫生物素化核苷酸。對于不太復雜的RNA，孵育時間可為37°C 30分鐘，若是更長或更復雜的RNA，時間也延長到4-16°C過夜。通過改變RNA與核苷酸的比例，延長孵育時間，或在標記反應中添加DMSO，可優化復雜RNA的標記效率。

　　RBP的富集過程經過優化，相當簡單。首先將RNA與鏈霉親和素磁珠結合。之后在蛋白質-RNA結合緩沖液中平衡RNA結合的磁珠，再加入蛋白裂解液。隨后添加適當的緩沖液、渦旋振蕩，并在磁力架上分離，洗滌磁珠。最后樣品可通過非變性的生物素洗脫緩沖液或 SDS-PAGE上樣緩沖液洗脫，用于下游分析。

　　此試劑盒的特點在于：

　　? 直接：直接利用末端標記的RNA捕獲核糖核蛋白復合物;不需要使用抗體進行pull-down

　　? 簡單：RBP富集過程無需離心;步驟簡化，在RNA標記反應后手工操作不到3小時

　　? 靈活：使用不同長度的體外轉錄RNA或合成RNA進行標記;可成功富集內源、過表達和體外翻譯的裂解液中的蛋白

　　? 特異：磁珠背景低;未處理的RNA或突變RNA不會明顯富集特定的RBP

　　? 經濟：比單獨購買合成的末端標記RNA、磁珠和試劑更為經濟

　　? 完整：包含標記和富集組分及分析緩沖液;陽性對照RNA、陰性對照RNA和RBP抗體也包含在內

　　此試劑盒包含的試劑足夠20次RNA標記反應和20次蛋白質-RNA pull-down分析使用。