硝酸還原酶活力測定可以用于：測量其催化植物體內的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的效率。
| 實驗方法原理 | 硝酸還原酶（NR）是植物氮素同化的關鍵酶，它催化植物體內的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,產生的亞硝酸鹽與對–氨基苯磺酸（或對–氨基苯磺酰胺）及α–萘胺（或萘基乙烯二胺）在酸性條件下定量生成紅色偶氮化合物。生成的紅色偶氮化合物在540nm波長下有最大吸收峰，可用分光光度法測定。硝酸還原酶活性可由產生的亞硝態氮的量表示。一般以Nμg·g-1·h-1為單位。NR的測定可分為活體法和離體法。活體法步驟簡單，適合快速、多組測定。離體法復雜，但重復性較好。 |
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| 實驗材料 | 作物葉片 |
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| 試劑、試劑盒 | 亞硝酸鈉標準液磷酸緩沖液對-氨基苯磺酸溶液α-萘胺溶液三氯乙酸溶液異丙醇磷酸緩沖液KNO3 |
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| 儀器、耗材 | 分光光度計真空抽氣泵天平單面刀片保溫箱刻度試管移液管 |
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| 實驗步驟 | 1. 標準曲線制作
取7支潔凈烘干的15ml刻度試管按表13-1順序加試劑，即配成0-2.0μg的系列標準亞硝態氮溶液。搖勻后在30℃保溫箱或恒溫水浴中保溫30min，然后在540nm波長下比色。以亞硝態氮（μg）為橫坐標，光密度值為縱坐標繪標準曲線或建立回歸方程。
表13-1 各試劑加入順序
2. 酶反應和酶活性測定
（1）取樣：將材料（小麥、玉米等作物葉片）洗凈，用蒸餾水沖洗，濾紙吸干。在葉片中部打取直徑1cm的圓片（或剪成0.5——1.0cm2的小塊），混勻后每個樣品稱0.5——1.0g 3份，放入試管并編號。
（2）反應：向各試管加入KNO3·異丙醇·磷酸緩沖液混合液9ml，其中一管立即加1.0ml三氯乙酸混勻作對照。然后將所有試管置真空干燥器中接真空泵抽氣，反復幾次直至葉片沉在管底。將各試管置30℃下于黑暗處保溫30min，分別向處理管加1.0ml三氯乙酸，搖勻終止酶活性。
（3）比色：將各試管靜置2min，吸取上清液2ml加入另一組試管，以對照管做參比，按標準曲線做法進行顯色測定，并計算酶活性（Nμg·g-1·h-1）。
式中 C：反應液催化產生的亞硝態氮總量（μg）；
V1：提取酶液時加入的緩沖液體積（ml）；
V2：酶反應時加入的粗酶液體積（ml）；
W：樣品重量（g）；
t：反應時間（h）。 展開 |
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| 注意事項 | 磺胺比色法比較靈敏，顯色速度易受溫度，酸度等因素的影響，因此要嚴格控制實驗條件，標準液與樣品反應液同時反應、比色。 |
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| 其他 | 硝酸還原酶活性的測定方法主要有離體法和活體法,又分別稱為離體法和活體法。離體法操作手續繁雜、要求條件較高;體內法簡便、快速,采用漸多。活體法存在NRA 測定值偏低、重復性不夠理想的缺點,因而需要針對不同的測定材料,對活體法做進一步的探討,確定最佳的測定條件。 |
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