硬實力！楊輝團隊Cell，Nature系列子刊等發表8項研究成果

　　近一年來中國科學院神經研究所楊輝團隊連續取得突破，在Cell， Protein & Cell，Nature Communications ，Nature Cell Biology，Nature Protocol，Nature Methods 等雜志上發表了8項重要研究成果，在基因編輯領域取得重大進展，iNature系統總結了這些研究成果：

　　【1】CRISPR-Cas9 介導的無縫基因組編輯可以通過同源定向修復 (HDR) 將供體 DNA 整合到 CRISPR-Cas9 靶基因座中來實現，盡管由于外源 DNA 的低效遞送而效率相對較低。 Retrons 是細菌-噬菌體防御相關的操縱子，由專門的逆轉錄酶 (RT) 和相關的非編碼 RNA (ncRNA) 組成，可以通過 RT 在保守的鳥苷 (G) 殘基處啟動來部分逆轉錄，以產生多拷貝的單鏈 DNA (msDNA)。retron 與 CRISPR-Cas9 結合可以通過 HDR 在細菌和酵母中通過將引導 RNA (gRNA) 融合到 retron ncRNA 的 3' 端，共價產生多拷貝單鏈 DNA (msDNA) 來增強精確的基因組編輯。但基于反轉錄子的基因組編輯系統效率還很低，且尚未證明能在哺乳動物細胞中發揮作用。盡管如此，反轉錄子在基因組編輯應用中仍顯示出獨特的優勢。2021年8月17日，中科院腦科學與智能技術卓越創新中心楊輝及輝大生物孔祥鋒共同通訊在Protein ＆ Cell 在線發表題為“Precise genome editing without exogenous donor DNA via retron editing system in human cells ”的研究論文，該研究通過將 Cas9 與來自不同進化枝的大腸桿菌 RT 融合，并在 retron ncRNA 的 5' 末端連接 gRNA ，進一步改造了 retron，并發現 retron 編輯可以在人類細胞中有效地實現精確的基因組編輯。通過在 HEK293T 細胞中共表達 Cas9-RT 融合和逆轉錄-ncRNA gRNA (rgRNA)，該研究證明內源性基因組位點逆轉錄編輯介導的 HDR 事件的發生率高達 10%。總之，該研究首次證明了細菌的防御系統反轉錄子（Retron）可以用于哺乳動物細胞的精確基因組編輯，而且可以避免Cas9帶來的DNA雙鏈斷裂，可能更加準確和安全。有望為體外和體內基因編輯治療帶來全新的基因編輯系統。

　　【2】CRISPR-Cas13和CRISPR-Cas12系統中新發現的特征（如“附帶效應”或反式切割）已使其能夠用于核酸檢測。據報道，Cas13a的側鏈RNA切割對細胞發育有害。作為CRISPR-Cas12系統的代表性基因編輯器，CRISPR-Cas12a（Cpf1）在未來的治療應用中具有巨大潛力。然而，當用于哺乳動物細胞中的基因組編輯時，目標激活的Cas12a有在復制，轉錄和同源性導向的修復過程中裂解瞬時暴露的ssDNA的風險，引起了人們的關注其治療應用。因此，需要仔細研究由Cas12a的不加區分的ssDNA裂解活性引起的潛在脫靶效應。2021年4月1日，中國科學院神經研究所周昌陽，楊輝及中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉等共同通訊在Protein & Cell 在線發表題為“Indiscriminate ssDNA cleavage activity of CRISPR-Cas12a induces no detectable off-target effects in mouse embryos”的研究論文，該研究開發了GOAT，無需FACS即可檢測基因編輯工具對全基因組的脫靶效應。與GOTI相比，GOAT是一種更簡單，成本更低的方法，具有相當的準確性和靈敏度。使用GOAT分析，該研究發現Cas12a（LbCas12a和AsCas12a）的反式ssDNA切割活性在小鼠胚胎中較低，這表明Cas12a在哺乳動物細胞中具有高度特異性。考慮到LbCas12a和AsCas12a具有與spCas9相當的編輯效率，更小的尺寸和更低的錯配耐受性，它們在未來的治療應用中具有廣闊的前景和競爭優勢。

　　【3】2021年1月4日，中國科學院神經研究所楊輝及周海波共同通訊在Nature Cell Biology 在線發表題為”Endogenous promoter-driven sgRNA for monitoring the expression of low-abundance transcripts and lncRNAs“的研究論文，該研究開發了一種通用的內源性轉錄門控開關，該開關在存在內源性啟動子的情況下釋放單向導RNA。 當內源轉錄門控開關與開發的高度敏感的CRISPR激活物相關報道分子偶聯時，可以可靠地檢測內源基因的活性，包括表達水平非常低的基因（相對于Gapdh，<0.001；定量PCR分析） 。值得注意的是，該研究還可以使用這種方法監測在活細胞中低水平表達的典型的長非編碼RNA的轉錄活性。總之，該研究方法提供了一個強大的平臺，可以感知細胞功能背后的內源性遺傳元素的活性。

　　【4】2020年11月27日，上海科技大學黃行許，池天及中國科學院神經研究所楊輝共同通訊在Nature Communications 在線發表題為“A Cas-embedding strategy for minimizing off-target effects of DNA base editors”的研究論文，該研究發現只需將將編輯酶插入nCas9的中間，就可以顯著降低A> G和C> T編輯器的脫靶效應，而不會破壞靶上編輯。 此外，采用這種Cas嵌入策略，該研究創建了一個高度特定的編輯器，能夠對甲基化和富含GC的序列進行高效C> T編輯。

　　【5】2020年8月14日，中國科學院神經研究所楊輝，中國科學院上海營養與健康研究所李亦學及斯坦福大學Lars M. Steinmetz共同通訊在Nature Protocol 在線發表題為“GOTI, a method to identify genome-wide off-target effects of genome editing in mouse embryos”的研究論文，該研究為GOTI提供了詳細的技術方案，包括小鼠交配，兩細胞胚胎注射，胚胎第14.5天胚胎消化，熒光激活細胞分選，全基因組測序和數據分析。為了增強GOTI的效用，該研究還包括一個稱為GOTI-seq（https://github.com/sydaileen/GOTI-seq）的計算流程，用于測序數據分析，可以生成最終的全基因組脫靶變異體直接從原始測序數據中提取。從小鼠交配到測序，該試驗方法通常需要20天，而測序數據分析則需要7天。

　　【6】2020年5月18日，中國科學院腦科學與智能技術卓越創新中心楊輝，究所隸屬于的計算生物學研究所（中國科學院-馬普學會計算生物學研究所）李亦學及中國農業科學院深圳農業基因組研究所左二偉共同通訊在Nature Methods 在線發表了題為"A rationally engineered cytosine base editor retains high on-target activity while reducing both DNA and RNA off-targeteffects"的研究論文，該研究根據蛋白結構預測了脫氨酶ssDNA結合的重要氨基酸，在不影響催化活性的情況下，突變相應的氨基酸（APOBEC1上的ssDNA結構域相應氨基酸），從而得到了顯著降低DNA脫靶的CBE突變體。

　　【7】2020年4月8日，中國科學院上海神經所楊輝及周海波共同通訊在Cell 在線發表題為“Glia-to-Neuron Conversion by CRISPR-CasRx Alleviates Symptoms of Neurological Disease in Mice”的研究論文，該項研究通過運用最新開發的RNA靶向CRISPR系統CasRx特異性地在視網膜穆勒膠質細胞中敲低Ptbp1基因的表達，首次在成體中實現了視神經節細胞的再生，并且恢復了永久性視力損傷模型小鼠的視力。同時，該研究還證明了這項技術可以非常高效且特異地將紋狀體內的星形膠質細胞轉分化成多巴胺神經元，并且基本消除了帕金森疾病的癥狀。該研究將為未來眾多神經退行性疾病的治療提供一個新的途徑。

　　【8】微生物和病毒之間的競爭性共同進化導致CRISPR-Cas防御傳染病的防御系統多樣化。2021年5月3日，上海腦科學與類腦研究中心、神經科學國家重點實驗室楊輝，周英思和中國農業大學農學院賴錦盛共同通訊在Nature Methods 在線發表題為“Programmable RNA editing with compact CRISPR–Cas13 systems from uncultivated microbes”的研究論文，該研究通過分析宏基因組的terabase數據集，鑒定了來自高鹽樣品的CRISPR-Cas核糖核酸的兩個緊湊家族（775至803個氨基酸（aa）），命名為Cas13X和Cas13Y。該研究設計了Cas13X.1（775 aa），用于哺乳動物細胞系中的RNA干擾實驗。該研究發現Cas13X.1可以耐受RNA識別中的單核苷酸錯配。此外，由工程化脫氨酶（385氨基酸）和截短的Cas13X.1（445氨基酸）組成的最小RNA堿基編輯器表現出強大的編輯效率和高特異性，可誘導RNA堿基轉化。該研究結果表明，天然微生物中存在尚未開發的細菌防御系統，可以有效地在哺乳動物細胞中發揮作用，因此可能對基于RNA編輯的研究有用。

　　CRISPR-Cas9 介導的無縫基因組編輯可以通過同源定向修復 (HDR) 將供體 DNA 整合到 CRISPR-Cas9 靶基因座中來實現，盡管由于外源 DNA 的低效遞送而效率相對較低。Retrons 是細菌-噬菌體防御相關的操縱子，由專門的逆轉錄酶 (RT) 和相關的非編碼 RNA (ncRNA) 組成，可以通過 RT 在保守的鳥苷 (G) 殘基處啟動來部分逆轉錄，以產生多拷貝的單鏈 DNA (msDNA)。逆轉錄后，msDNA 通常通過 ncRNA 中的啟動 G 和 msDNA 的 5' 端之間的 2',5'-磷酸二酯鍵共價連接到 ncRNA。逆轉錄過程，其中專門的 RT 識別逆轉錄 ncRNA 的獨特二級結構。此外，通過用所需序列替換逆轉錄 ncRNA 的可有可無區域，可以在體內生成所需的 msDNA。因此，retron 是體內生成 DNA 供體用于 HDR 介導的精確基因組編輯的有前途的生物來源。

　　最近，一些研究表明，retron 與 CRISPR-Cas9 結合可以通過 HDR 在細菌和酵母中通過將引導 RNA (gRNA) 融合到 retron ncRNA 的 3' 端，共價產生多拷貝單鏈 DNA (msDNA) 來增強精確的基因組編輯。在本研究中，通過將 Cas9 與來自不同進化枝的大腸桿菌 RT 融合并在 retron ncRNA 的 5' 末端連接 gRNA ，進一步改造了 retron，并發現 retron 編輯可以在人類細胞中有效地實現精確的基因組編輯。通過在 HEK293T 細胞中共表達 Cas9-RT 融合和逆轉錄-ncRNA gRNA (rgRNA)，該研究證明內源性基因組位點逆轉錄編輯介導的 HDR 事件的發生率高達 10%。研究人員希望逆轉錄編輯系統可以幫助推進逆轉錄的體外和體內治療應用。

　　示意圖顯示Cas9-Ec73 RT融合原位逆轉錄3'Ec73 rgRNA，生成包含具有同源臂的單鏈供體序列的msDNA，并將msDNA并入Cas9切割的基因組位點

　　鑒于可以通過增加供體 DNA 的局部豐度來增強 HDR 介導的精確編輯，而 CRISPEY 策略通過原位表達逆轉錄-gRNA 嵌合分子顯示出在酵母基因組中的高效編輯。因此，該研究試圖通過在 gRNA 的 5' 或 3' 端融合逆轉錄 ncRNA，即逆轉錄-ncRNA gRNA (rgRNA)，對共價連接到 gRNA 的供體 msDNA 進行原位逆轉錄。該研究首先試圖測試人類細胞中 msDNA 的相對豐度。該研究發現所有四個選定的 RT 都能夠在人類細胞中表達 msDNA，并且與 5' rgRNA 相比，retron RT 與 3' rgRNA 的結合顯示出更高的 msDNA 表達。結果表明，retron RT 在人類細胞中具有逆轉錄功能。

　　接下來，該研究探索了逆轉錄編輯在人類 HEK293T 細胞中的潛力。為了確定 EMX1 和 HEK3 的逆轉錄編輯介導的 HDR 效率，該研究進行了深度測序。在測試的四個逆轉錄子中，Ec86、Ec73 和 Ec107 實現了不同程度的精確編輯，并且 Ec73 與 CRISPR-Cas9 結合顯示出最高的活性，高達 10%。總之，該研究結果表明 Cas9-Ec73 RT 融合與 3' Ec73 rgRNA 結合可用于人類細胞中有效的精確基因組編輯。此外，該研究檢查了與 EMX1 基因座相關的四個報告的 CRISPR-Cas9 脫靶位點，以確定逆轉錄編輯的脫靶效應。盡管帶有 rgRNA 的 Cas9-Ec73RT 在目標位點誘導的插入缺失率與帶有 sgRNA 的 Cas9 相似，但帶有 rgRNA 的 Cas9-Ec73RT 在四個已知的脫靶位點顯示活性降低。

　　可以采取許多方法來改善人類細胞中的逆轉錄編輯。首先，鑒定更適合人類細胞基因組編輯的逆轉錄子。其次，retron-RT 和retron-ncRNA 的工程進化可以用來增強retron 介導的ssDNA 細胞內生產。最后，有證據表明與 Cas9 (D10A) 切口酶 (RDN) 融合的 hRAD51 突變體可以在沒有 DSB 的情況下介導精確的基因組編輯。由于消除了 Cas9 誘導的 DSB，可以預期逆轉錄與 RDN 的組合可能使逆轉錄編輯更加準確和安全。

　　該研究由輝大生物科技有限公司研發部孔祥鋒博士和腦智卓越中心汪子康博士、張仁霞博士研究生等在楊輝博士的指導下完成。輝大生物科技有限公司研發部施霖宇博士、王興博士和腦智卓越中心周英思博士對該研究做出了重要貢獻。

　　參考消息：

　　https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs13238-021-00862-7