本實驗描述了將磷酸肽鏈/非磷酸肽鏈和磷酸酪氨酸交聯到 Affi-Gel 10 親和介質上以利用親和柱層析法純化抗體的方法。
| 實驗方法原理 | 本方案描述了將磷酸肽鏈或非磷酸肽鏈交聯到 Affi-Gel 10 親和介質上以利用親和柱層析法純化抗體的方法。這里所詳述的無水交聯法是最有效的肽鏈交聯方法。按此法的步驟最終能產生 3 ml 柱床體積的親和樹脂；每毫升Affi-Gel 10上能交聯 3 μl 肽。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | 二甲基亞砜（DMSO）N-甲基嗎啉乙醇胺乙醇胺·HClPBS／疊氮化物高鹽／高 pH 溶液高鹽／低 pH 溶液NaClNaSCN |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1. 用 0. 5～4 倍柱床體積的 DMSO 溶解肽。 2. 如下滴定中和肽溶液：每次滴加 1～2 μl 肽合成級的 N-甲基嗎啉（原液或以 1:1 至 1:9 稀釋于 DMSO 中），然后取出 2～3 μl 稀釋于50 μl 水中，滴加到 pH 試紙上。 重復上述操作直至 pH 為 7～8。 滴定要仔細，因為很容易超過所需的 pH 范圍。一般每 3 μmol 肽需要用 7～8 μl N-甲基嗎啉滴定，具體的量主要取決于特定的氨基酸序列。取出的等份必須與水混合再測 pH，因為 pH 是測量氫離子的濃度，因此非水溶液無法測量 pH。 3. 將裝有 Affi-Gel 10 介質的瓶子搖蕩混合以使樹脂充分懸浮，取需要量的樹脂到帶螺口蓋的聚丙烯離心管，用 DMSO 洗3次，每次于室溫以 700 g 離心 5 min ,吸去上清，重懸于5倍體積的 DMSO 中，然后再次 700 g 離心。 4 . 從樹脂上吸取多余的 DMSO，加入步驟 2 配制的肽溶液。室溫下旋轉混合孵育過夜。 5. 每毫升樹脂加入2 μl 乙醇胺，室溫下旋轉混合孵育 2 h。 6. 按步驟 3 的方法用 DMSO 洗 2 次。 7. 按步驟 3 的方法用 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl，pH 8.0 洗 2 次（第一次洗滌在冰上操作，因為會產生大量的熱量)。第二次洗漆后，吸去洗滌液，換上新鮮的 0.1 mol/L 乙醇胺 · HCl 并于 4℃ 旋轉混合孵育過夜。然后低速離心，吸去上清。 8. 按步驟 3 的方法用高鹽/高 pH 溶液洗 3 次。 9. 按步驟 3 的方法用高鹽/低 pH 溶液洗 3 次。 10. 按步驟 3 的方法用 PBS/疊氮化物溶液洗3次，然后將洗過的樹脂儲存在 4℃ 以備裝填柱子。 11. 用 0.5 mol/L NaCl 將介質制成懸浮液，倒入玻璃層析柱。 12. 依次用 10 倍柱體積的 3 mol/L NaSCN 和 10 倍柱體積的 PBS/疊氮化物溶液洗柱。 |
| 注意事項 | 確保至少吸取所需體積兩倍量的Affi-Gel 10，因為體積會縮減。所買的樹脂一般是50% 的懸浮液，因此必需取所需柱床體積 4 倍的量。不要以高過推薦的速度離心，因為這樣會損壞樹脂。 |