磷酸肽分析的常見困難是由磷酸化的低化學計量值導致的，樣品中相同序列肽段的磷酸肽的含量要比非磷酸化肽段含量少得多，這種情況下即使 32p標記的 2D-PP 上的點，經全蛋白質水解及 HPLC 組分收集，已經確定磷酸肽存在，用質譜技術也難以鑒定磷酸肽。數據依賴的 MS/MS 方法不能鑒定樣品中含量少的成分，因為 CID 優先選擇豐度高的離子進行分析，為了解決這一問題常用 IMAC 選擇性富集磷酸脫這一技術將 Fe3+ 或 Ga2+等金屬離子整合到含有亞氨基二乙酸 (iminodiacetk acid) 或次氮基三醋酸 (nitrilotriacetic acid) 的色譜固定相上。磷酸肽與固定相有高親和力，被選擇性地吸附在上面。用磷酸鹽或高 pH 溶液洗脫，洗脫組分即為富集的磷酸肽。雖然這一方法對磷酸肽有選擇性，但其他肽，特別是那些富含酸性氨基酸鏈的肽段也容易被富集。IMAC 柱上洗脫下的組分可用不同的 MS 方式分析。本方法的優點是每一個可溶磷酸肽，不管其長度如何，都能被富集，而且 IMAC柱洗脫下的樣品可直接用于 RP-HPLC 分析。可以建立串聯的 IMAC/RP 柱結構，將肽的富集和分離整合到一起。 展開 | 