磷酸化位點分析實驗磷酸肽的分離

蛋白質磷酸化水平是由兩個作用相反的酶系一一磷酸酶和激酶來調控的。這些酶中大部分的納構、專一性、調控已被深入研究過。 據估計有幾百種蛋白激酶／磷酸酶，它們有不同的底物、動力學特性、組織分布及其與調控通路的關系。通過對釀酒酵母全基因組 DNA 序列中被認為代表蛋白激酶（磷酸酶）的序列基元 (motif) 的分析表明、酵母能夠表達 123 種不同的蛋白激酶 (40 種蛋白磷酸酶）．這就暗示 2%的酵母蛋白參與了蛋白質磷酸化過程。了解蛋白質磷酸化對功能的影響可以深入理解生命系統如何在分子水平進行調控，例如，一個單一的磷酸化過程可以調節糖原磷酸化酶的活性。對蛋白質酪氨酸激酶 p561ck 的研究工作表明，在單個絲氨酸上的磷酸化［可能是由促分裂原活化蛋白 (MAP) 激酶所致］, 能夠改變一個酶的底物專一性。酪氨酸磷酸鹽誘導的蛋白質相互作用已經表明其提供了穩定蛋白質復合物所需的支架，這種蛋白質復合物表現出復雜的生物功能，持別是在細胞間的信號傳導過程中, 因此可以明顯看出可逆的蛋白質磷酸化是一種非常重要的蛋白質修飾，它能改變酶的催化活性和底物的專一性，調節具有調控功能的蛋白質復合物的穩定性和亞細胞定位，從而擴展生物活性和功能。

蛋白樣品

質譜儀

本質上，任何分析蛋白質磷酸化位點的方法都要依靠對所研究磷酸化蛋白質的純化，用酶或化學方法水解磷蛋白，分離、分析產生的磷酸肽。幸運的是，前面部分所述的用于處理丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質的方法同樣適用于磷蛋白的分析。所以，用于產生磷酸肽樣品的方法是：用凝膠電泳分離蛋白質，水解蛋白質條帶或蛋白斑點，提取產生的磷酸肽混合物作進一步分析。雖然磷蛋白在 SDS-PAGE的遷移通常比其非磷酸化的蛋白慢，但是，在一維膠上著到兩條遷移非常接近的條帶．或在 2- DE 上觀察到．系列有相同分子質量但不同等電點的斑點，這樣的現象并不足以確定某一個蛋自是磷酸化蛋白。用³²p 標記后放射自顯影，或磷儲屏分析 (storage phosphorimaging). 或用 Western 印跡方法鑒定磷蛋白的結果較為確定、可信。用現有的方法在常規實驗中就可將³²p放射標記物摻入體內或體外磷酸蛋白質中。分子放射標記方法用于體內磷酸化蛋白質標記，要標記的細胞或組織與³²PO₄孵育一段時間，使細胞 ATP 庫與³²p平衡。放射標記的 ATP 被蛋白激酶用于磷酸化其底物。體外蛋白質磷酸化的激酶反應用[γ-³²p] ATP 作為放射標記物來源，粗分的細胞裂解液或純化的激酶作為激酶活性來狠。 Western印跡在檢測酪氨酸磷酸化蛋白方面特別成功，因為已經開發出一系列非常靈敏的酪氨酸磷酸鹽特異性抗體, 同時也因為此方法沒有放射性同位素標記，泛磷酸特異性抗體或磷酸－絲氨酸和磷酸－蘇氨酸特異性抗體的開發還不太成功。

細胞內的許多磷酸化蛋白的含量非常少．幾乎不可見。即使蛋白質的表達量處于相對較高的水平，磷蛋白的分析也很困難，因為蛋白磷酸化的化學計量值常常很低，某一個蛋白質中僅有一少部分袚磷酸化，某一蛋白質中也會存在多種不同的磷酸化類型。由于這些原因，即使用當前最靈敏的分析方法，也很難分離到足夠量用于分析的體內磷酸化蛋白質。因此許多蛋白質的磷酸化研究是在體外利用激酶反應使蛋白質被磷酸化修飾，通常能夠擴大反應規模以產生大盤的磷酸化蛋白 。在體外研究確定的磷酸化位點被認為具有生物學意義之前，必須證實在體內存在相同的磷酸化位點。通常通過比較體內和體外的同一磷酸化蛋白質的二維磷酸肽圖得知（圖 5.S)。體外磷酸肽產生的量大，經化學或質譜分析作為金考證實體內微量磷酸肽的鑒定。當各自的磷酸肽在譜圖中共遷移時則可認為體內、體外磷蛋白有相同的磷酸化位點。因此．這個方法通過與一個結構清楚的參考樣品肽共遷移在某種程度上間接證實了一個體內磷酸化位點的確定。