磷酸化位點分析實驗磷酸肽的質譜分析

用于確定磷酸肽中磷酸化位點的壓譜方法有兩種不同的基本原理。

第一種方法依賴于在質譜儀條件下，如在 ESI 質譜儀的碰撞室或離子源中，或MALDI-MS 的 PSD 過程中，磷酸酯鍵的化學穩定性。因此，磷酸肽可通過磷酸酯鍵斷裂產生的診斷離子鑒定。

第二種方式依靠檢測磷酸酯基團使肽段增加的質量數。通常，在蛋白質磷酸化研究中所研究的蛋白質序列是已知的，因此，從理論上可以通過對磷酸基團加合在絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上引起的 8011 的質量數差的分析而檢測蛋白產生的磷酸肽。因此，得到磷酸化蛋白質的酶切肽質量啟通常由 MALDI-MS 分析，如果質量測定值與預期值一致，就可鑒定混合物中的磷酸肽。這兩種方法不能鑒定出肽內的磷酸化位點。磷酸化位點的確定要靠能夠有效測序的串聯質譜的產物離子掃描技術。但是，在肽序列中只有一個可能的磷酸化位點情況下，如果能確實證明此肽段為磷酸肽磷酸化殘基也能有效定位。如果磷酸化氨基酸類型已確定，無須離子掃描即能鑒定磷酸化位點的機會也會大大提高。

蛋白樣品

質譜儀

下面講的 MS 掃描方式，已經成功用于磷酸肽的分析。總之，在不能摻入³²p或標記物已經衰變到檢測限以下的情況下．產生磷酸鹽特異離子（例如一個診斷離子）的方法是很有用的。如果希望的話這種掃描模式也能用于分析放射性標記的磷酸肽，因為由放射性同位素磷酸鹽對磷酸肽貢獻的質量非常小，可忽略不計。需要注意的是，雖然有人擔心質譜儀會被 ³²p樣品污染．但這種可能性可以避免，只要在質譜實驗之前等侯足夠數量的半衰期 (32p的半衰期為兩周）。需耍標記的實驗，例如2D-PP 作圖，可以在放射性活度足夠強的時候做。

1. 源內 CID

可用 ESI 源內 CID 產生的負離子形式的診斷離子， H₂PO₄- (97u),P0₃- (79u). P0₂- (63u), 來檢測鑒定磷酸肽。源內 CID 與在線 HPLC 結合，既可鑒別磷酸肽的洗脫時間，得到其色譜標識，又能得到其分子質量。具體做法是，在 Q1 之前的兩個 skimmer 上加高的錐孔（cone）電壓，掃描低質荷比的診斷離子。然后將 cone 電壓恢復正常值（不會誘導產生解離）掃描高質荷比的離子。儀器的第一個 skimmer 位置使用加熱的毛細管的質譜儀也能做類似的實驗。這個方法使用了交替掃描技術，即在高八極桿補償電壓下進行診斷離子的選擇性離子監測 (selecetion monitoring, SIM), 之后進行兩個全掃描。第一個全掃描使用與 SIM 實驗相同的高補償電壓，產生去質子化的磷酸肽分子離子及去磷酸的磷酸肽分子離子。最后在正常八極桿補償電壓下進行第二次金掃描，產生一個參考圖。與高八極桿補償電壓下的全掃描比較。在 LC 分離過程中這種二次質譜掃描系列連續地重復進行,這個實驗提供了相同的信息，但是因為使用SIM, 而不是掃描來檢測診斷離子，每一個掃描循環更快速，也可能更靈敏。高八級桿補償電壓下的第一次全掃描與低補償電壓下的全掃描相比較，在多個肽段被共洗脫時，可以提供線索找到磷酸肽離子，肽混合物被微毛細管柱分離時，經常會有肽段共洗脫。這一技術分析磷酸肽標準品通常可低至幾個fmol 上柱量。但對平體內、體外的實際樣品，靈敏度通常在 pmol 范圍。因為負離子的 CID 譜通常不能產生足夠用于序列分析的碎片離子，如果能用微毛細管柱分離，在線連接 ESI-MS 系統，以負離子形式檢測磷酸肽，然后切換到正離子模式的 CID 分析．當然會非常方便。目前采用診斷離子掃描模式的質譜儀這樣做在技術上還有困難，也許將來使用非掃描模式的質譜儀可以達到這一目的。在四極桿這樣的掃描質譜儀上做這一實驗的困難在于不能達到正、負離子模式轉換所要求時間。

2. 中性丟失掃描

中性丟失掃描是在二級四極質譜儀上用 ESI 正離于模式分析的。 Q1 沒有用來為 Q2 中的裂解選擇離子，而是用來掃描。Q3 也用來掃描，但質量掃描范圍與 Q1 不同，確切地說，兩個四極桿以不同的質量范圍掃描，它們之間的差值與丟失的中性分子質荷比一致。對于從 [M+2H]²⁺磷酸肽上丟失的中性磷酸鹽，其質量差值為 m/z 49 。從機理上看，只有磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸會發生β-消除，產生 98 的中性丟失。此方法的應用并不如源內 CID 方法普遍，因為會出現假陽性，而且還必須知道丟失磷酸鹽的離子帶電荷的狀態。此方法的優點是以正離子模式進行分析，可以在同一次實驗中通過檢測磷酸鹽的中性丟失啟動 CID. 得到數據依據的 CID 掃描。

3. 前體離子掃描

此方法是在 ESI 負離子模式下對 Q1 進行連續掃描。所有的離子都在 Q2 中裂解， 03 中僅能通過一種離子，對磷酸肽來說通常是丟失的 po₃- 基團(m/z 79) 。因此，質譜結果僅顯示會丟失 m/z79 的離子的譜峰。這大大簡化了混合物的分析，在納噴離子源直接進樣過程中可以分析得很好。如磷酸肽的診斷離子掃描一節所述，此方法還是存在測序的問題，即負離子模式檢測磷酸丟失后，立即切換為正離子模式測序。

4. 產物離子掃描

由上文所述的特定掃描法得到的信息通常還不足以鑒定磷酸肽中的磷酸化殘基。實際上，如源內 CID, 中性丟失和母離子掃描，是用來將磷酸肽從非磷酸肽中區別出來，而不是提供序列信息。只有在肽序列已知，且三種含羥基氨基酸只有一種存在的情況下，以上三種方法才能成功鑒定磷酸化殘基。此外，只有在肽序列中只含有一個絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的情況下，這種預先設定對答案的簡化才起作用。在另一種情況下也可以提供肽序列中磷酸化位點的答案，即序列已知，磷酸化的氨基酸分析表明在此磷酸蛋白中只含有三種羥基氨基酸的一種時，再次簡化了答案。當這兩種情況都不存在時卡通常需要產生CID譜，并予以解析以確定磷酸肽的共價結構。觀察磷酸肽的低能 CID過程，其一般趨勢是，磷酸絲氨酸上的磷酸比磷酸蘇氨酸更易丟失，磷酸蘇氨酸比磷酸酪氨酸更易丟失磷酸，較短的磷酸肽比較長的磷酸肽更易于丟失磷酸，大概是由于在相同碰撞能量下，短肽的化學鍵上分布了更多的能量。有趣的是，很少能觀察到磷酸氨基酸的亞氨離子，磷酸氨基酸的 immonium 離子是由磷酸丟失后形成的脫羥基丙氨酸和脫羥基-2-丁酸的斷裂形成的。然而，用離子阱質譜監測磷酸肽的 CID 譜了在肽碎片離子譜中觀察到脫羥氨 -2-丁酸取代了蘇氨酸的位置。

已經發展了許多不同的策略和方法用質譜確定磷酸肽中的磷酸化位點，其區別在于質譜與肽分離技術的接口方式，以及所用的質譜方法。如果一個磷酸肽有 1pmol 或更多的量，磷酸肽就能夠從 2D-PP 譜中提取出來，并用數據依賴的自動化的微毛細管 LC-MS/MS 分析。此方法快速，可以初步估計一個 2D-PP 斑點中磷酸肽的相對量，通過對 2D-PP 譜圖的配比，有可能定性、定量地了解細胞或組織在不同肽態下分離的磷酸化蛋白在特定位點的磷酸化過程對于樣品量大大低于 1pmol 量的樣品，磷酸肽信號通常被平板中提取的雜質所干擾而看不到，這種情況下建議用毛細管液相色譜或凝膠電泳分離肽段。