磷酸氨基酸分析實驗

磷酸化蛋白質

印度墨汁 HCl 磷酸氨基酸混合物 電泳緩沖液 茚三酮

PVDF膜 烘箱 離心機 離心管 纖維素薄層色譜 濾紙 薄層電泳儀

1.  放射性標記的磷酸化蛋白質在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行制備電泳。電轉移至PVDF膜上，用水洗膜數次，不要讓膜變干。 

2.  用30~50 ml 印度墨汁染色液染膜5~10 min，輕搖至條帶出現。也可在作好放射性或磷光位置標記后，用塑料膜包住膜，進行放射性自顯影。 

3.  用干凈刀片切下含目的條帶的膜，用甲醇將膜重新潤濕1 min，再用多于0.5 ml 水的潤濕。置于帶螺口蓋的微量離心管。

4.  加入足夠量的6 mol/l HCl，淹沒膜，擰緊管蓋，在110℃烤箱溫育60 min。

5.  自然冷卻，高速離心2 min，將液相的水解物移至一個新的微離心管中，真空干燥2 h。

6.  加入6~10 μl 水，在旋渦混合器上劇烈振蕩以溶解樣品，高速離心5 min。

7.  取25%~50%的樣品點樣于20 cm×20 cm×100 μm 纖維素薄層色譜板的樣品孔。分小份點樣，毎次點加0.25~0.5 μl，在每次點加之間，用通過塞有棉花的巴斯德吸管所送出的壓縮空氣吹干加樣點。

8.  取1 μl 非放射性的磷酸氨基酸標準混合物（含磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸和磷酸酪氨酸）點在每個樣品之上，如上分次點加，每次0.25~0.5 μl。

9.  在大的玻璃托盤或塑料盒內，用pH1.9電泳緩沖液浸濕大的吸水紙（帶4個孔），緩緩倒干多余的緩沖液。將此大吸水紙轉移覆蓋在已加樣的薄層色譜板上，使得色譜板上的4個加樣點位干大吸水紙的四個洞的中央，輕壓吸水紙以潤濕纖錐素和樣品，當色譜板均勻潤濕后，移去吸水紙。

10.  將薄層色譜板置于電泳裝置內，在板的左右兩倆0.5 cm 邊緣用Whatman 3MM 紙搭接，如果有氣泡，將其弄平排出。蓋上蓋子，開始電泳。在HTLE 7 000電泳儀用雙層厚的Whatman 3MM 紙搭接時，載4個樣品的薄層板在1.5 KV 電泳20 min。
 

圖1 磷酸氨基酸在pH1.9進行第一向電泳分離
 

11.  電泳后，取出薄層板，用電吹風快速吹干20 min（無須加熱）。

12.  用pH3.5電泳緩沖液湲濕小的吸水紙，并如步驟10所述以之去均勻潤濕薄層色譜板，注意避免將吸水紙放在樣品之上。

13.  取去小吸水紙，色譜板逆時計轉90^。進行第二向的電泳。如使用HTLE 7 000電泳儀，用pH3.5的電極緩沖液，在1.3 KV 電壓下電泳16 min。

14.  電泳后取出簿層板，在50~80℃烤箱內干烤20~30 min 至完全干燥，噴0.25%茚三酮丙酮溶液，再加熱5~10 min 使磷酸氨基酸標準品顯跡。

15.  在薄層色譜板上加放射性或發磷光的定位標記后，使用增感屏在-70℃自顯影，時間從過夜到約10天不等。 

16.  自顯影完畢，在透明的投影膠片上描上定位標記和染色顯跡的標準磷酸氨基酸的位 置，保留色譜板。即可通過對比投影片和感光片來鑒定出放射活性的磷酸氨基酸。

圖2  磷酸氨基酸在pH3.5進行第二向電泳分離


圖3  雙向電泳分離的放射性自顯影模式圖