磷酸鈣細胞轉染技術

[實驗目的]
　　1 了解細胞轉染技術原理和基本方法
　　2 磷酸鈣沉淀法的基本技術要點

[實驗原理]
　　磷酸鈣沉淀法是基于磷酸鈣-DNA復合物的一種將DNA導入真核細胞的轉染方法，磷酸鈣被認為有利于促進外源DNA與靶細胞表面的結合。磷酸鈣-DNA復合物粘附到細胞膜并通過胞飲作用進入靶細胞，被轉染的DNA可以整合到靶細胞的染色體中從而產生有不同基因型和表型的穩定克隆。這種方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。可廣泛用于轉染許多不同類型的細胞，不但適用于短暫表達，也可生成穩定的轉化產物。

[儀器、材料和試劑]
　　1　呈指數生長的真核細胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纖維細胞）
　　2　完全培養液（依所用的細胞系而定）
　　3　CsCl純化的質粒DNA （10～50μg/次轉染，二次純化）
　　4　2×HEPES緩沖鹽水(HeBS)
　　(pH6.95～7.05)　50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。用0.5mmol/L NaOH調pH至6.95～7.05,過濾除菌后,-20℃保存備用。
　　5　 2.5mol/L CaCl2過濾除菌,-20℃保存備用。
　　6　磷酸緩沖鹽水（PBS）
　　7　37℃，5%CO2的加濕培養箱
　　8　100mm組織培養平板
　　9　15ml錐形管
易生物儀器庫：[方法與步驟]
　　1　傳代細胞準備　細胞在轉染前 24ｈ傳代,待細胞密度達50%～60%滿底時即可進行轉染。加入沉淀前3～4h，用9ml完全培養液培養細胞。
　　2　DNA沉淀液的準備　首先將質粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm平板），空氣中晾干沉淀，將DNA沉淀重懸于μL無菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。

　　3 用巴斯德吸管在500μL　2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同時用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整個過程需緩慢進行，至少需持續1～2min。
　　4 室溫靜置30min,出現細小顆粒沉淀。
　　5 將沉淀逐滴均勻加入10cm平板中，輕輕晃動。
　　6 在標準生長條件下培養細胞4～16h。除去培養液，用5ml　1×HeBS洗細胞2次，加入10ml完全培養液培養細胞。
　　7 收集細胞或分入培養皿中選擇培養。
　　[注意事項]
　　1 在整個轉染過程中都應無菌操作。
　　2 為獲得最佳實驗結果，DNA應不含蛋白質和酚。乙醇沉淀后的DNA應保持無菌，并在無菌水或Tris EDTA中溶解。
　　3 沉淀物的大小和質量對于磷酸鈣轉染的成功至關重要。在磷酸鹽溶液中加入DNA-CaCl2溶液時需用空氣吹打，以確保形成盡可能細小的沉淀物，因為成團的 DNA不能有效地粘附和進入細胞。

　   4 在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質量，因為甚至偏離最優條件十分之一個pH都可能導致磷酸鈣轉染的失敗。

[參考文獻]
　　1, Graham, F.L. and Van der Eb, A.J. (1973) Virology 52, 456.
　　2, Wigler, M., Silverstein, S., Lee, L.S., Pellicer, A., Cheng, Y.C. and Axel, R. (1977) Cell 11, 223.
　　3, Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection Kit Cat. no. K2780-01
　　4, Invitrogen Corporation Calcium Phosphate Transfection System Cat. no. 18306-019
　　5, Invitrogen Corporation 陽離子脂質體轉染指南,2003,(1)
　　6, 顏子穎等譯　精編分子生物學實驗指南　北京：科學技術出版社,1998,274-328
　　7, 晶美實驗新知 晶美生物工程有限公司
　　8, 李華等 基因導入的脂質體轉染法和磷酸鈣轉染法之比較,中國實驗動物學雜志,2000,10,(2)：65-68