神經膠質細胞培養實驗_酶消化法

膠質細胞具有復雜多樣的結構和表達豐富的分泌產物，它含有大部分神經遞質、神經肽、激素及神經營養因子受體、離子通道、神經活性氨基酸親和載體、細胞識別分子，并能分泌多種神經活性物質(生長因子、神經營養因子和細胞因子等)。

神經細胞（神經元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經生長因子和膠質細胞因子時，可出現一定程度的分化，長出突起等現象，但很難使之增值。而神經膠質細胞是神經組織中比較容易培養的成分。

大鼠

MEMFBS胰酶EDTAD-Hanks’液

眼科剪滴管離心機培養皿CO2培養箱

1. SD 大鼠經低溫麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒，無菌操作下，斷頭放入預冷的D-Hanks’液中，在解剖顯微鏡下取大腦皮層并除去腦膜。

2. 剪碎組織成1 mm³ 大小，加入胰酶-EDTA消化液并放入 37℃孵箱內消化20 min，中間搖晃一次。

3. 隨后用滴管吸出組織轉移到裝有預冷的 MEM＋10%FBS(Glial Medium，GM)的離心管內終止消化液作用5 min。

4. 吸出組織轉移到另一支裝有冷的 GM 的離心管內，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，靜置后取上清并吸到另一支離心管內。重復上述步驟 2～3 次。

5. 所得上清于800 rpm 離心5 min，棄上清，管內加入新鮮培養液并吹打成單細胞懸液。細胞計數，調整細胞密度1.5×10⁵/cm² 種入 25 cm² 培養瓶，放入孵箱培養。以后每隔2～3 d 進行全量換液。

6. 搖床振搖分離星形膠質細胞和少突膠質細胞：培養至7～10 天，換液后放入孵箱繼續培養24 h，取出擰緊培養瓶蓋，于37℃恒溫搖床上280 rpm 搖 動18 h。此時寡突膠質細胞 90%以上在培養懸液內而與瓶底貼壁的星形膠質細胞分離。

7. 分離培養懸液內的少突膠質細胞：吸出懸液至離心管內950  rpm 離心10  min，棄上清后管內加入新鮮GM，吹打成單細胞懸液，按1.5×10⁵/cm² 種入預先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的 35 mm 培養皿培養。24 h 后換成DF12＋N2 的無血清 培養液，此后每三天半量換液1 次。

8. 瓶底星形膠質細胞的繼續培養：25 cm² 培養瓶內的星形膠質細胞用D-Hanks’液洗2 次后常規傳代，以 1.5×10⁵/cm² 種入預先用100 µg/L 多聚賴氨酸包被好的35 mm 培養皿培養。培養液為GM，每三天半量換液1 次。附GFAP鑒定星形膠質細胞圖片。

圖1：星形膠質細胞(GFAP 鑒定)

做原代混膠細胞，相對來說比較好養。