實驗方法原理 測定肝素的方法主要有生物測定法、紫外分光光度法、化學法。肝素分子具有強負電性，能與帶正電荷的分子結合生成復合物。天青A是一種堿性染料，和肝素生成的復合物表現出“光異色現象”，即改變染料原有的吸收光譜。控制染料濃度，在pH 8.6介質中肝素濃度低時，505 nm的光吸收與肝素濃度的關系符合朗-比爾定律。
實驗材料 腸粘膜或豬肝
試劑、試劑盒 巴比妥緩沖液 阿拉伯膠 天青A 肝素
儀器、耗材 燒杯 試管 試管架 玻棒 磁力攪拌器 電爐 吸濾瓶 布氏漏斗 離心機 722分光光度計 容量瓶 真空干燥器 真空泵 水浴鍋 濾紙 布袋。精密pH試紙
實驗步驟
溶液配制：
1. 巴比妥緩沖液(pH 8.6，0.05 mol/L)：稱取1 g氫氧化鈉溶于50 ml沸水 ，再精確稱取二己基巴比妥酸5052 g溶于上述溶液中，冷卻后稀釋至500 ml，pH計校正到pH8.6。
2. 0.1%阿拉伯膠溶液：稱取0.5 g，先用少量水分散，再稀釋至500 ml，過濾備用。
3. 0.1%天青A溶液(稱取0.5 g，先用少量水在研缽中研磨溶解，再稀釋至500 ml，過濾，冰箱儲備。用時再稀釋5倍。
4. 肝素標準溶液：準確稱取一定量的肝素標準品，用滅菌水配成100 U/ ml的標準溶液，冰箱暫放 ，用時以水稀釋100倍。
操作步驟：
1.提取（鹽解法）
新鮮豬腸粘膜2 kg（或豬肝搗碎），加入氯化鈉80 g（4%濃度），攪拌溶解后用40%氫氧化鈉溶液調p H至9.0（用廣泛pH試紙），水浴加熱至50～55 ℃攪拌提取2 h，然后升溫至90℃保持10 min，冷卻至60 ℃用布袋過濾，取濾液待離子交換用。
2.離子交換
將濾液用水稀釋3倍，加入D254樹脂（氯型）120 g（按投料量6%，W/W），慢速攪拌6 h（可每隔1 h抽樣測定提取液中剩余肝素的含量），過濾取樹脂。
3.洗滌、洗脫
取離子交換后的樹脂先用自來水洗凈，而后用蒸餾水洗凈。取洗凈樹脂加入等體積1.4 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌1 h，過濾取樹脂。繼續用0.5倍體積的5 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h，過濾收集濾液（取樣測含量）。樹脂再加入0.5倍體積的3 mol/L氯化鈉溶液，慢速攪拌1 h，過濾，濾液收集（取樣測含量）。樹脂再用0.5倍3 mol/L氯化鈉溶液慢速攪拌2 h，過濾，濾液收集（取樣測含量），合并三次洗脫濾液。
4.粗制肝素
取合并濾液加入1.5～2倍體積的95%乙醇洗一次，丙酮洗兩次，真空干燥即得粗品肝素。
5.精制肝素
稱取粗制肝素粉末用1%氯化鈉溶液（預冷卻）適量溶解，調pH1.8左右，離心15 min，上清液經砂心漏斗去除離心液表面的脂肪。懸液在水浴上加熱至80～90 ℃，滴加0.0003 mol/L高錳酸鉀溶液（按0.1～0.2 mol/億單位），用濾紙法檢測終點，濾液加入30%過氧化氫，調p H至11，放置36 h（冰箱內）。抽濾，濾液調pH至6.4，加入1倍體積的95%乙醇，離心，沉淀用95%乙醇洗二次，丙酮洗兩次，真空干燥即得精制肝素。
6.天青法測定效價
（1）標準曲線的制作:取較大試管（易混勻）6支，以0～5編號，按下表操作。加入阿拉伯膠后必須搖勻方可加入染料，混勻后用722型分光光度計測505 nm處吸收值，以吸收值為縱坐標，單位數為橫坐標繪制標準曲線。
（2）樣品測定:精確稱取樣品約10 mg，先配成1 mg/ml溶液，再以2個100 ml容量瓶稀釋為1 mg/100 ml溶液、2 mg/100 ml測定液，按下表操作并記錄吸收值，分別從標準曲線上查出相應單位數，按下式計算樣品效價，取平均值。
單位為U/ mg ，式中Pi 為由A 值在標準曲線上查出的單位數；V 為測定樣品的總毫升數；Vi 為測定所用樣品的毫升數；Sw 為稱取樣品的毫克數。