離子交換色譜的流動相必須是有一定離子強度的并且對pH有一定緩沖能力的溶液。選擇流動相時需要考慮以下幾方面。
1、離子交換后，流動相pH的改變
基于離子交換的原理，目的分子在與介質上的反離子交換后，釋放到溶液中的反離子可以使液相中的離子強度增大，pH可能會發生改變，有可能導致目的分子失活。所以，使用緩沖液可穩定流動相的pH，同時還可穩定目的分子上的電荷量，保證分離結果的重現性。
2、選擇一合適的吸附pH
要使目的分子帶有電荷并以適當的強度結合到離子交換介質上，需要選擇一個合適的吸附pH。對于陰離子交換介質來說，吸附pH至少應高于目的分子等電點1個pH單位；而對于陽離子交換介質，則應至少低于目的分子等電點1個pH單位，這樣可保證目的分子與介質間吸附的完全性。
3、吸附pH選好后，還需選擇流動相的離子強度
吸附階段應選擇允許目的分子與介質結合達到的最高離子強度，而洗脫時要選擇可使目的分子與介質解吸的最低離子強度。這也就定出了洗脫液離子強度的梯度起止范圍。在介質再生之前，往往還需用第三種離子強度更高的緩沖液流洗柱床，以徹底清除可能殘留的牢固吸附雜質。在大部分情況下，吸附階段溶液鹽濃度至少應在10mmol/mL以上，以提供足夠的緩沖容量，但濃度不可過高，否則將影響載量。