離子交換色譜的流動相必需是有一定離子強度的并對pH 有一定緩沖能力的溶液。為了避免目的蛋白失活，使用緩沖液可穩定流動相的pH，使之在色譜過程中不發生明顯變化，同時可穩定目的分子上的電荷量，保證色譜結果的重要性。選擇緩沖液一般按照以下原則：陽離子交換劑應選用陰離子緩沖液，可用檸檬酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、甘氨酸鹽等；陰離子交換劑應選用陽離子緩沖液，可用烷基胺、Tris、氨基乙醇胺、乙二胺、咪唑等；起始緩沖液的濃度應盡可能低（<100mmol/L）這樣可以使色譜柱上更多的吸附分離物質；緩沖液應不含會影響被分離物質活性和溶解度成分，洗脫時盡量不采用pH梯度洗脫。