科學家首次利用CRISPR來加速特定基因在哺乳動物中遺傳

　　在經典遺傳學理論中，通過孟德爾定律，親代等位基因有50%的機會被下一代遺傳。2003年，進化生物學家Austin Burt提出了基因驅動（gene drive）理論【1】。一些基因具有自我復制功能，如轉座子等，可以利用具有這些功能的元件對目的基因進行改造，這樣可以使得后代可以以大于50%的機會偏好性遺傳目的基因，隨著后代的延續整個群體的基因型都會被改變。即利用超孟德爾遺傳（Super-Mendelian inheritance）對生物群體進行遺傳學工程改造。這種方法可以改造病原傳播群體，比如一些蚊子是瘧疾、登革熱或寨卡病毒的重要傳播源，理論上可以利用這種技術降低疾病的傳播率。

　　近期CRISPR技術的日益成熟加速了基因驅動的發展。CRISPR技術包括gRNA和Cas9兩部分，gRNA引導Cas9對目標DNA進行切割產生雙鏈斷裂（double strand break, DSB）。細胞利用自身損傷修復功能對DSB進行修復，通常有兩種結果：一種是非同源末端連接修復（non-homologous end joining, NHEJ），NHEJ會在DSB位點引入核苷酸的插入和缺失（insertions of deletions, indels）發生效率較高，會造成目的基因功能缺失性突變；另一種是同源重組修復（homology directed repair ，HDR），HDR可以以另一條同源染色體或人工外源序列作為模板，實現定向編輯。基因驅動技術利用了CRISPR的HDR，具體過程見下圖。

圖片來源: https://en.wikipedia.org/wiki/Gene_drive

　　一般情況下，特定突變會以孟德爾方式在群體中遺傳。在Cas9和gRNA作用下，通過HDR的機制，雜合型目的基因（在這里標記為Cargo）在個體中趨向于變純合，從而在遺傳中逐步占據優勢以至于改變整個群體遺傳構成。2014年，來自哈佛大學的科學家們提出了CRISPR應用于基因驅動的想法【2】。2015年，科學家證實了在酵、果蠅和蚊子中， CRISPR可以成功高效地實現基因驅動【3-5】。但是由于遺傳機制的差異，這種系統尚未在哺乳動物中成功開發。基因驅動在哺乳動物中可以用來抵抗有害群體的入侵，也可以用于優化實驗動物模型。

　　1月23日，Nature雜志在線發表了來自加州大學圣地亞哥分校（UCSD）Kimberly Cooper實驗室的題為Super-Mendelian inheritance mediated by CRISPR–Cas9 in the female mouse germline的文章，首次在小鼠中成功開發了基因驅動技術。

　　在這項研究中，作者進行了精細巧妙的實驗設計。用CopyCat這段序列插入到酪氨酸酶基因第四個外顯子中，造成酪氨酸酶功能失活（TyrCopyCat）。因為白化病是由酪氨酸酶異常引起，這種方法人為造成了小鼠的白化病，可以根據小鼠的毛發顏色來追蹤引入的基因突變（下圖）。gRNA附近有mCherry的紅色熒光標記，理論上成功實現HDR的小鼠中可以追蹤到mCherry的表達。

利用CRISPR-Cas9技術在小鼠中實現基因驅動的策略。圖片引自：Nature

　　不同小鼠中分別帶有gRNA的目的基因TyrCopyCat和表達Cas9，這樣可以靈活控制CRISPR的反應。將這兩種品系的小鼠交配繁殖，基因驅動可能在子代中發生。表達Cas9的小鼠的酪氨酸酶第五個外顯子上有chinchilla（南美洲栗鼠）的亞等位基因（ hypomorphic allele），這種小鼠為灰色。Chinchilla與TyrCopyCat的距離有9.1KB，因此在自然條件下，這兩個標記間幾乎不會發生交換重組。這種實驗條件下，理論上交配后會產生三種等位基因（下圖），一種是沒有發生CRISPR介導的基因表型改變，只有chinchilla，這種基因作為顯性存在時小鼠毛發為灰色；一種是發生了CRISPR介導的基因表型改變，但是只有NHEJ過程，因為造成了酪氨酸酶的功能缺失，這種等位基因為顯性時，小鼠為白色，但會在酪氨酸酶上檢測到indels； 還有一種是發生了HDR的CRISPR改變，這種等位基因為顯性時，小鼠為白色，可以檢測到chinchilla、TyrCopyCat和mCherry的同時存在，只有這一種才是基因驅動成功的標志。

　　作者首先利用Rosa26和H11這兩種幾乎在所有組織中都能表達的啟動子來驅動Cas9，發現這種條件下得到的主要是NHEJ的基因編輯。控制Cas9的表達對實現基因驅動至關重要。作者隨后選擇了在生殖系中特異表達的啟動子來驅動Cas9，因為生殖系中本身會在減數分裂時發生交換重組，抑制NHEJ可能會促進HDR。實驗證實這種策略是有效的，在雌性小鼠中，作者可以觀察到72%的HDR發生。基因驅動在雌性小鼠中有效，然而在雄性小鼠中尚不成功。

　　這項研究證實了CRISPR介導的基因驅動在小鼠中應用成功，雖然在將基因驅動用于控制野生小鼠種群之前，還需要開展進一步的工作，但這一研究結果或有助于開發改良小鼠模型，用于研究復雜的遺傳疾病。還需要進一步開展工作以增加雄性和雌性小鼠后代的基因遺傳頻率，但此次研究所實現的效率足以滿足很多實驗室的應用要求。同期Nature配有相應News & Views文章對此工作進行評論（下圖）。

　　值得一提的是，這項工作在2018年7月被提交到預印本雜志bioRxiv上，當時就引起了主流媒體的強勢圍觀，Nature和Science在都曾討論過此研究【6, 7】。

　　在以制作基因修飾小鼠聞名的Jackson laboratory領導技術研發的Michael Wiles評價此項方法是“非常有用的”。因為很多人類疾病是由多種基因引起的，而制作這種小鼠模型要花費大量時間和人力物力。“通常制作同時具有6種遺傳修飾的小鼠需要大概5年，而利用基因驅動技術，一年就可以辦到。”

　　來自澳大利亞阿萊德萊大學（ the University of Adelaide）的小鼠遺傳學家 Paul Thomas稱這項研究是“向在哺乳動物中開發基因驅動中邁出的重要的第一步”。Paul Thomas實驗室一直致力于開發小鼠中的基因驅動技術來防治嚙齒類生物入侵。

　　同樣來自澳大利亞的小鼠遺傳學家Gaétan Burgio評價此工作“是非常好的研究同時具有重要的意義”，“我們之前對嚙齒類動物中的基因驅動一無所知，我們曾認為它的效率可能跟在果蠅中同樣高，但事實并非這樣”。

　　即使這項工作的目的是改造實驗動物，來自MIT Mdia Lab的進化生物學家Kevin Esvelt說“令人不安的是，這項工作沒有提到保護措施”。他認為如果將基因驅動動物釋放到野外的話，需要有個開關來關閉基因驅動的活性并將動物恢復到自然狀態。

　　原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-0875-2

　　參考文獻

　　1. Burt, A. 2003. Site-specific selfish genes as tools for the control and genetic engineering of natural populations. Proceedings. Biological sciences 270: 921-928.

　　2. Esvelt, K. M., A. L. Smidler, F. Catteruccia, and G. M. Church. 2014. Concerning RNA-guided gene drives for the alteration of wild populations. eLife 3.

　　3. DiCarlo, J. E., A. Chavez, S. L. Dietz, K. M. Esvelt, and G. M. Church. 2015. Safeguarding CRISPR-Cas9 gene drives in yeast. Nature biotechnology 33: 1250-1255.

　　4. Gantz, V. M., and E. Bier. 2015. Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations. Science (New York, N.Y.) 348: 442-444.

　　5. Hammond, A., R. Galizi, K. Kyrou, A. Simoni, C. Siniscalchi, D. Katsanos, et al. 2016. A CRISPR-Cas9 gene drive system targeting female reproduction in the malaria mosquito vector Anopheles gambiae. Nature biotechnology 34: 78-83.

　　6. Callaway, E. 2018. Controversial CRISPR 'gene drives' tested in mammals for the first time. Nature 559: 164.

　　7. Cohen, J. 2018. A 'gene drive' makes its debut in mammals. Science (New York, N.Y.) 361: 118.