生活污水與工業廢水中含有大量各類有機物。當其污染水域后，這些有機物在水體中分解時要消耗大量溶解氧，從而破壞水體中氧的平衡，使水質惡化，因缺氧造成魚類及其它水生生物的死亡。這樣的污染事故在我國時有發生。
水體中所含的有機物成分復雜，難以一一測定其成分。人們常常利用水中有機物在一定條件下所消耗的氧來間接表示水體中有機物的含量，生化需氧量即屬于這類的重要指標之一。
生化需氧量的經典測定方法是稀釋接種法；日本1990年頒布了微生物電極法（JIS K 3602—1990），其中使用了微生物膜傳感器，每次測定儀需20 min。我國也研制出以微生物電極為核心的相關快速BOD測定儀，其方法已通過多家試驗室驗證，實際水樣測定及與標準稀釋接種法對照，取得了良好的效果。
測定生化需氧量的水樣，采集時應充滿并密封于瓶中，在0～4 ℃下進行保存，一般應在6 h內進行分析。若需要遠距離轉運，在任何情況下，貯存時間不應超過24 h。
一、稀釋接種法
1.方法原理
生化需氧量是指在規定條件下，微生物分解存在于水中的某些可氧化物質，特別是有機物所進行的生物化學過程中消耗溶解氧的量。此生物氧化全過程進行的時間很長，如在20 ℃培養時，完成此過程需100多天。目前國內外普遍規定20 ℃±1 ℃培養5 d，分別測定樣品培養前后的溶解氧，二者之差即為BOD5值，以氧的毫克/升表示。
對某些地表水及大多數工業廢水，因含較多的有機物，需要稀釋后再培養測定，以降低其濃度和保證有充足的溶解氧。稀釋的程度應使培養中所消耗的溶解氧大于2 mg/L，而剩余溶解氧在1 mg/L以上。
為了保證水樣稀釋后有足夠的溶解氧，稀釋水通常要通入空氣進行曝氣（或通入氧氣）使稀釋水中溶解氧接近飽和。稀釋水中還應加入一定量的無機營養鹽和緩沖物質（磷酸鹽鈣、鎂和鐵鹽等），以保證微生物生長的需要。
對于不含或少含微生物的工業廢水，其中包括酸性廢水、堿性廢水、高溫廢水或經過氯化處理的廢水，在測定BOD時應進行接種，以引入能分解廢水中有機物的微生物。當廢水中存在著難于被一般生活污水中的微生物以正常速度降解的有機物或含有劇毒物質時，應將馴化后的微生物引入水樣中進行接種。
2.方法的適用范圍
本方法適用于測定BOD5大于或等于2 mg/L，最大不超過6000 mg/L的水樣。當水樣BOD5大6000 mg/L，會因稀釋帶來一定的誤差。
3.儀器
①恒溫培養箱（20 ℃±1 ℃）；②5～20 L細口玻璃瓶；③1000~2000 ml量筒；④玻璃攪棒：玻璃攪棒的長度應比所用量筒高度長200 mm，在棒的底端固定一個直徑比量筒底小、并帶有幾個小孔的硬橡膠板；⑤溶解氧瓶：250～300 ml之間，帶有磨口玻璃塞并具有供水封用的鐘形口；⑥虹吸管，供分取水樣和添加稀釋水用。
4.試劑
①磷酸鹽緩沖溶液：此溶液的pH應為7.2；②硫酸鎂溶液；③氯化鈣溶液；④氯化鐵溶液；⑤鹽酸溶液（0.5 mol/L）；⑥氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）；⑦亞硫酸鈉溶液（1/2Na2SO3＝0.025 mol/L）：需每天配制；⑧葡萄糖-谷氨酸標準溶液：此標準溶液臨用前配制。⑨接種液。
稀釋水：在5～20 L玻璃瓶內裝入一定量的水，控制水溫在20℃左右。然后用無油空氣壓縮機或薄膜泵，將吸入的空氣先后經活性炭吸附管及水洗滌管后，導入稀釋水內曝氣2～8 h，使稀釋水中的溶解氧接近于飽和。曝氣亦可導入適量純氧。瓶口蓋以兩層經洗滌晾干的紗布，置于20 ℃培養箱中放置數小時，使水中溶解氧含量達8 mg/L左右。臨用前每升水中加入氯化鈣溶液、氯化鐵溶液、硫酸鎂溶液、磷酸鹽緩沖溶液各1 ml，并混合均勻。
接種稀釋水：分取適量接種液，加于稀釋水中，混勻。每升稀釋水中接種液加入量為：生活污水1～10 ml；表層土壤浸出液20～30 ml；河水，湖水10～100 ml。接種稀釋水的pH值應為7.2，BOD5值以在0.3~1.0 mg/L之間為宜。接種稀釋水配制后應立即使用。
5.步驟
（1）水樣的預處理
①水樣的pH若超出6.5～7.5范圍時，可用鹽酸或氫氧化鈉稀溶液調節pH近于7，但用量不要超過水樣體積的0.5％。若水樣的酸度或堿度很高，可改用高濃度的堿或酸液進行中和。
②水樣中含有銅、鉛、鋅、鎘、鉻、砷、氰等有毒物質時，可使用經馴化的微生物接種液的稀釋水進行稀釋，或提高稀釋倍數以減少毒物的濃度。
③含有少量游離氯的水樣，一般放置1～2 h，游離氯即可消失。對于游離氯在短時間不能消散的水樣，可加入亞硫酸鈉溶液除去。其加入量由下述方法決定：取已中和好的水樣100 ml，加入（1＋1）乙酸10 ml，10％碘化鉀溶液1 ml，混勻以淀粉溶液為指示劑，用亞硫酸鈉溶液滴定游離碘。由亞硫酸鈉溶液消耗的體積，計算出水樣中應加亞硫酸鈉溶液的量。
④從水溫較低的水域或富營養化的湖泊中采集的水樣可遇到含有過飽和溶解氧，此時應將水樣迅速升溫至20 ℃左右，在不使滿瓶的情況下，充分振搖，并時時開塞放氣，以趕出過飽和的溶解氧。從水溫較高的水域或廢水排放口取得的水樣則應迅速使其冷卻至20 ℃左右，并充分振搖，使與空氣中氧分壓接近平衡。
（2）不經稀釋水樣的測定
①溶解氧含量較高、有機物含量較少的地表水，可不經稀釋而直接以虹吸法將約20℃的混勻水樣轉移入兩個溶解氧瓶內，轉移過程中應注意不使產生氣泡。以同樣的操作使兩個溶解氧瓶充滿水樣后溢出少許，加塞。瓶內不應留有氣泡。
②其中一瓶隨即測定溶解氧，另一瓶的瓶口進行水封后，放入培養箱中，在20 ℃±1 ℃培養5d。在培養過程中注意添加封口水。
③從開始放入培養箱算起，經過五晝夜后，棄封口水，測定剩余的溶解氧。
（3）需經稀釋水樣的測定
①稀釋倍數的確定。根據實踐經驗，提出下述計算方法，供稀釋時參考。
（i）地表水：由測得的高錳酸鹽指數與一定的系數的乘積，即求得稀釋倍數，見表1。
（ii）工業廢水：由重鉻酸鉀法測得的COD值來確定，通常需作三個稀釋比。使用稀釋水時，由COD值分別乘以系數0.075，0.15，0.225，即獲得三個稀釋倍數。使用接種稀釋水時，則分別乘以0.075，0.15和0.25三個系數。
②稀釋操作。
（ii）一般稀釋法。按照選定的稀釋比例，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀釋水（或接種稀釋水）于1000 ml量簡中，加入需要量的均勻水樣，再加入稀釋水（或接種稀釋水）至800 ml，用帶膠板的玻棒小心上下攪勻。攪拌時勿使攪棒的膠板露出水面，防止產生氣泡。
按不經稀釋水樣的測定相同操作步驟進行裝瓶、測定當天溶解氧和培養5d后的溶解氧。另取兩個溶解氧瓶，用虹吸法裝滿稀釋水（或接種稀釋水）作為空白試驗，測定5d前后的溶解氧。
（ii）直接稀釋法。直接稀釋法是在溶解氧瓶內直接稀釋。在已知兩個容積相同（其差＜1 ml）的溶解氧瓶內，用虹吸法加入部分稀釋水（或接種稀釋水），再加入根據瓶容積和稀釋比例計算出的水樣量，然后用稀釋水（或接種稀釋水）使剛好充滿，加塞，勿留氣泡于瓶內。其余操作與上述一般稀釋法相同。
BOD5測定中，一般采用疊氮化鈉改良法測定溶解氧。如遇干擾物質，應根據具體情況采用其他測定法。
6.計算
（1）不經稀釋直接培養的水樣
式中：C1——水樣在培養前的溶解氧濃度（mg/L）；C2——水樣經5 d培養后，剩余溶解氧濃度（mg/L）。
（2）經稀釋后培養的水樣
式中：B1——稀釋水（或接種稀釋水）在培養前的溶解氧（mg/L）；B2——稀釋水（或接種稀釋水）在培養后的溶解氧（mg/L）；f1一稀釋水（或接種稀釋水）在培養液中所占比例；f2——水樣在培養液中所占比例。
7.精密度和準確度
三個實驗室分析含5 mg/L葡萄糖的統一標準液的BOD5值，實驗室內相對標準偏差為5.6％；實驗室間相對標偏差為32％。三個實驗分析含300 mg/L葡萄糖（BOD5為210 mg/L）的統一標準液的BOD5值，實驗室內相對標準偏差為2.1％，實驗室間相對標準偏差為2.19％。
8.注意事項
①水中有機物的生物氧化過程，可分為兩個階段。第一階段為有機物中的碳和氫，氧化生成二氧化碳和水，此階段稱為碳化階段。完成碳化階段在20 ℃大約需20 d。第二階段為含氨物質及部分氨，氧化為亞硝酸鹽及硝酸鹽，稱為硝化階段。完成硝化階段在20 ℃時需要約100 d。因此，一般測定水樣BOD5時，硝化作用很不顯著或根本不發生硝化作用。但對于生物處理池的出水，因其中含有大量的硝化細菌。因此，在測定BOD5時也包括部分含氮化合物的需氧量。對于這樣的水樣，如果我們需要測定有機物降解的需氧量，可以加入硝化抑制劑，抑制硝化過程。為此目的，可在每升稀釋水樣中加入1 ml濃度為500 ml/L的丙烯基硫脲（ATC）或一定量固定在氯化鈉上的2-氯代一6-三氯甲基吡啶（TCMP），使TCMP在稀釋樣品中的濃度大約為0.5 mg/L。
②玻璃器皿應徹底洗凈。先用洗滌劑浸泡清洗，然后用稀鹽酸浸泡，最后依次用自來水、蒸餾水洗凈。
③在兩個或三個稀釋比的樣品中，凡消耗溶解氧大于2 mg/L和剩余溶解氧大于1 mg/L，計算結果時，應取其平均值。若剩余的溶解氧小于1mg/L，甚至為零時，應加大稀釋比。溶解氧消耗量小于2mg/L，有兩種可能，一是稀釋倍數過大，另一種可能是微生物種不適應，活性差，或含毒物質濃度過大。這時可能出現在幾個稀釋比中，稀釋倍數較大的消耗溶解氧反而較多的現象。
④為檢查稀釋水和接種液的質量，以及化驗人員的操作水平，可將20 ml葡萄糖一谷氨酸標準溶液用接種稀釋水稀釋至1000 ml，按測定BOD5的步驟操作。測得BOD5的值應在180～230 mg/L之間。否則應檢查接種液、稀釋水的質量或操作技術是合存在問題。
⑤水樣稀釋倍數超過100倍時，應須先在容量瓶中用水初步稀釋后，再取適量進行最后稀釋培養。