突破！李慶閣團隊將PCR檢測能力提升一個數量級以上

實時熒光PCR (rtPCR) 是目前應用最廣的核酸檢測技術，檢測模式采用閉管檢測，相對于開管檢測而言，rtPCR極大降低了擴增產物的污染機會，節省了時間和人力，便于實現自動化，更可以利用閾循環數（Cq值）支持定量檢測。然而，rtPCR的一個很大局限在于單個反應所能檢測的靶基因數目有限。根據目前主流熒光PCR儀器檢測通道數目，單個反應所能檢測的靶基因數目很難超過4-6個，限制了該技術在涉及多靶點的復雜疾病上的應用。在PCR反應后添加熔解分析步驟，可在一定程度上增加可檢測靶基因數目，但是，伴隨熒光探針類型的增加，熒光背景及檢測成本也隨之升高，尤其是，探針結合區任何核酸變異都可能引起熔點偏移，導致結果誤判，使得該法對于靶標數目的提升依然受限。與那些廣受矚目的高通量檢測技術相比，已有30年歷史的rtPCR似乎正成為一種“低階”核酸檢測技術。

在2022年2月24日在線發表于《美國國家科學院院刊》（PNAS）的一項研究中，廈門大學生命科學學院李慶閣團隊報道了一種稱為“MeltArray”的熒光PCR新技術，一舉將熒光PCR的單管檢測能力提高到一個數量級以上，并通過多個臨床應用場景，系統展示了該技術強大而靈活的檢測能力。

為驗證MeltArray的多重檢測能力，研究團隊首先成功實現了一個20重人類Y染色體無精子因子區域(AZFa、AZFb、AZFc和AZFd)的18個序列標簽位點和2個參照基因（SRY基因和ZFX/Y基因）的MelArray檢測體系。受該結果鼓舞，研究團隊開始挑戰更多的靶標數目，成功實現了一個62重用于識別61種O抗原合成基因及1個大腸桿菌管家基因yccT的MeltArray檢測體系。上述兩個例子均為定性檢測，那么，MeltArray可否另外進行定量檢測呢？為回答這一問題，研究團隊成功實現了一個24重能夠同時定性檢測19種非定植菌/病毒和1個內控基因，并定量檢測4種細菌的MeltArray檢測體系。最后，研究團隊考察了MeltArray用于突變分析的可行性，成功實現了在單個反應管內一一鑒定出發生在KRAS基因密碼子12和密碼子13上的9種類型的突變。

MeltArray的以上四個應用場景，實際上對應了分子診斷的三大應用領域，即遺傳病、傳染病（又分別涉及到病原體鑒定及病原體定性、定量檢測這些細分領域）和腫瘤的分子診斷，顯示出MeltArray做為通用核酸檢測技術的典型特征。當前，實現類似靶標數目的檢測均需“開管檢測”技術，如芯片、質譜、微球、電泳等，然而這些技術普遍存在設備昂貴，操作復雜、周轉時間長等缺點，且國產化率低，在國內外市場上不溫不火，長期進展緩慢。相對而言，MeltArray采用廣泛可及且已國產化的熒光PCR儀器，具有明顯的成本低、操作簡便、自動化程度高、周轉時間短等諸多優勢，結合本文所展現的強大而靈活的技術優勢，不僅成功推動熒光PCR這一“老技術”再上“新臺階”，也完美填補了長期存在于低階PCR和高通量檢測二者之間的技術空白！

廈門大學生命科學學院黃秋英助理教授、博士生陳冬梅、杜琛為共同第一作者，生命科學學院李慶閣教授、公共衛生學院廖逸群副教授為共同通訊作者，共同作者包括廈門大學碩士生劉巧巧、林素、梁蘭蘭、許曄副教授。該研究得到了國家科技重大專項（No. 2017ZX10302301 & No. 2017ZX10303406）、國家自然科學基金（No. 81672110）、福建省社會發展高校產學合作項目（No. 2019Y4002）、廈門市科技計劃項目（No. 3502Z201830070 & No. 3502Z20183013）的資助。本文所描述的MeltArray技術已在中國、美國、歐洲、日本、韓國獲得ZL授權，并向澳大利亞等國遞交了ZL申請。

李慶閣團隊長期從事熒光PCR尤其是多重熒光技術平臺研究，2001年報告一種新的寡核苷酸雜交反應模式（Nucleic Acids Research），發明置換探針和置換引物（中、美、日、澳及歐洲ZL授權）；2004年提出置換探針基因分型技術（Nucleic Acids Research）；2006年發明探針編碼實時PCR（Clinical Chemistry，中國發明ZL授權）；2011提出自淬滅探針的多色探針熔解曲線變異分析技術（Journal of Molecular Diagnostics，中、美ZL授權），2013年提出基于連接反應的“熒光—熔點”二維標記技術（Nucleic Acids Research, 中、美、歐洲ZL授權）。