除保留了第一代的對革蘭氏陽性菌的作用外,由于它們對革蘭氏陰性桿菌產生的β-內酰胺酶較第一代穩定,抗菌譜也較第一代廣,所以顯著地擴大和提高了對革蘭氏陰性桿菌作用。對革蘭氏陽性細菌,除對痢疾桿菌和沙門氏菌顯示較強的抗菌活性外，對大腸桿菌、肺炎桿菌的抗菌作用優于第一代頭孢菌素。它們對第一代頭孢菌素抗菌作用較差的變形桿菌和產氣桿菌亦有一定的抗菌活性，對不動桿菌的抗菌作用較差。對綠膿桿菌和糞鏈球菌均無抗菌活性。對金葡菌、腦膜炎球菌具有很強的抗菌活性，與第一代頭孢菌素相近。
第二代頭孢菌素按化學結構可分為兩小類，即酰胺型頭孢烯和頭霉素類。
①酰胺型頭孢烯類。包括頭孢孟多、頭孢替安和肟型的頭孢呋辛。頭孢孟多抗革蘭氏陽性菌的活性較第一代的頭孢唑啉稍差，而抗革蘭氏陰性桿菌的作用優于第一代頭孢菌素。頭孢替安抗革蘭氏陽性菌的活性與頭孢孟多相似，而對革蘭氏陰性桿菌中的大腸桿菌、肺炎桿菌和奇異變形桿菌等的抗菌作用則優于頭孢孟多和頭胞西丁。頭孢呋辛抗革蘭氏陽性菌的活性與頭孢孟多相似。由于在7-β位上有順式構型的甲氧亞基（肟型）的結構，妨礙β-內酰胺酶分子接近β-內酰胺環,因而能耐受β-內酰胺酶水解。對葡萄球菌和某些革蘭氏陰性桿菌產生的β -內酰胺酶較頭孢孟多穩定。
②頭霉素類。在第二代頭孢中有頭霉素類（甲氧基型頭孢）的頭孢美唑、頭孢西丁和頭孢替坦。由于它們在7-α 位上具有甲氧基，所以具有抗厭氧菌和需氧菌的雙重廣譜特性，且對革蘭氏陰性菌產生的 β-內酰胺酶較穩定。外科和婦產科以厭氧菌和需氧菌的混合感染較為多見，而頭霉素類藥物是值得選用的藥物。這些7-α 甲氧基型頭孢菌素對粘質塞拉蒂氏菌、吲哚陽性變形桿菌、耐β -內酰胺類的革蘭氏陰性桿菌和厭氧如擬桿菌的活力均高于無 7-α甲氧基的同系物。與肟型頭孢菌素相比，甲氧基型頭孢菌素對頭孢菌素酶的水解具有較高的抵抗力，同時對此酶也有抑制活力。在頭霉素中頭孢美唑在抗菌譜和抗菌活力兩方面都優于頭孢西丁。