第二十七期質譜沙龍活動報道

　　2010年6月5日下午，第二十七期質譜沙龍活動在解放軍第二炮兵總醫院藥劑科舉行。來自解放軍第二炮兵總醫院、AB公司、北京師范大學分析測試中心、空軍總醫院、安貞醫院的20余位專家、技術人員參加了此次沙龍活動。

第二十七期質譜沙龍活動現場

 

免疫抑制劑及其合并用藥LC-MS/MS高通量檢測方法研究

解放軍第二炮兵總醫院 李鵬飛老師

　　首先，來自解放軍第二炮兵總醫院的李鵬飛老師通過題為《免疫抑制劑及其合并用藥LC-MS/MS高通量檢測方法研究》的報告，向大家介紹了最近備受關注的使用液質聯用技術進行免疫制劑方面的實驗。李老師主要從事他克莫司免疫制劑的研究，包括開發他克莫司檢測試劑盒。

　　李老師首先介紹了一下免疫抑制劑的研究背景。上世紀90年代比較注重的治療藥物監測(TDM)和60年代開始在臨床應用的器官移植，都不同程度的促進免疫抑制劑的發展。而LC-MS/MS高通量能同時檢測免疫抑制劑及合并用藥在人血中的濃度，因此它的研究日益得到重視。

　　治療藥物監測(TDM)是對治療指數窄、毒性作用強、個體差異大的藥物，測定其血液或其他體液中的藥物濃度，根據藥動學原理制定個體給藥方案。TDM藥物的特點：安全范圍窄，治療濃度范圍與中毒濃度很接近；無明顯的、可觀察的治療終點或指標；劑量、藥物作用之間的關系不可知；藥物中毒與無效時均很危險等。器官移植成為21世紀醫學發展的主要方向之一。免疫抑制劑作為器官移植學三大支柱之一，是器官移植成敗的關鍵。目前在臨床實踐中實體器官移植尚不能徹底停用免疫抑制劑，因此器官移植依然處于免疫抑制劑時代，免疫抑制劑的長期應用及其不良反應的控制仍是臨床移植醫學研究的重點。常用的免疫抑制劑有：環孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)、霉酚酸酯(MMF)、腎上腺糖皮質激素硫唑嘌呤。

　　LC-MS/MS高通量的意義在于能提供免疫抑制劑及合并用藥的血藥濃度，為臨床個體化給藥提供依據，為進一步驗證或確認藥物之間的相互作用提供方法支持，都是更好地為臨床服務。

　　在實驗中，李老師采用了3200QTrap型液相色譜-串聯質譜儀，配有電噴霧離子源(ESI)以及Analyst1.4.2數據處理軟件，和Agilent1100高效液相色譜系統等儀器。該試驗分為五個階段：第一階段：建立擬測定藥物各自的質譜條件；第二階段：建立同時檢測多種藥物濃度的色譜條件；第三階段：建立同時檢測樣本的前處理方法；第四階段：定量分析方法的驗證；第五階段：用建立的檢測方法檢測未知生物樣本。以下為上述五個階段的分析方法：

　　第一階段，建立擬測定藥物各自的質譜條件。通過儲備液配置，蠕動泵模式進樣，找到各自優化條件；

　　第二階段，建立同時檢測多種藥物濃度的色譜條件。包括流動相組成、色譜柱、流動相隨時間變化(梯度)、柱溫、進樣量；

　　第三階段，樣品前處理及內標選擇。生物樣品前處理方法包括沉淀蛋白法、固相萃取法、液-液萃取法和固相微萃取法。內標的選擇包括有1-2中不常用藥物、1種非藥物以及同位素內標這三種不同的選擇，李老師在試驗中選擇沉淀蛋白法(甲醇)和1-2種不常用藥物(替米沙坦)的內標法。

　　第四階段，定量分析方法的驗證。其中包括驗證方法的專屬性，標準曲線與線性范圍，精密度與準確度試驗，提取回收率和基質效應以及穩定性試驗。

　　第五階段，檢測實際樣本中，李老師采用二炮醫院服用免疫抑制劑患者血漿樣本30例檢測結果，以及朝陽醫院腎移植患者全血樣本192例檢測結果進行比較，得出比較可靠的結果。

　　在試驗過程中，李老師也遇到了一些問題。比如，使用霉酚酸做試驗時，由于標準樣和實際樣存在差異，血漿和全血中濃度可能不同。奧美拉唑和尼卡地平響應值太高，在高濃度值處接近質譜儀響應的上限，故響應與濃度不成比例，導致檢測偏差較大等。

　　最后，李老師得出的結論為在《免疫抑制劑及其合并用藥LC-MS/MS高通量檢測方法研究》的課題中，采用LC-MS/MS高通量檢測方法快速、靈敏，專屬性強、重現性好，可以用于人體血漿中硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤、潑尼松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍、地塞米松、奧美拉唑、地爾硫卓、尼卡地平、非洛地平、霉酚酸的濃度測定。因此，在免疫抑制劑及其合并藥的研究中越來越受到重視。

　　本網收錄前沿Lab：第二炮兵總醫院分析中心

　　本網收錄相關產品：3200 Qtrap 四極桿-線性阱雜交質譜儀

　　報告下載：《免疫抑制劑及其合并用藥LC-MS/MS高通量檢測方法研究》

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混合炸藥種類識別及溯源方法研究

北京師范大學分析測試中心 田菲菲老師

　　來自北京師范大學分析測試中心的田菲菲老師為大家帶來了題為《混合炸藥種類識別及溯源方法研究》的報告。

　　研究意義

　　2004年7月，大興安嶺地區某居民樓一房門被炸，在現場提取到少許未燃盡的炸藥殘留物。用氣相色譜和離子色譜技術進行分析，檢測出TNT和硝酸銨混合炸藥，為偵破案件提供了重要的線索。因此，田老師指出掌握爆炸案件現場爆炸殘留物的檢驗方法，對于嚴厲打擊利用爆炸進行的犯罪活動有著十分重要的意義。

　　炸藥成分

　　田老師指出乳化炸藥、銨油炸藥和銨銻炸藥是目前我國工業炸藥中使用最為廣泛的三種。這三種炸藥的主要成為都均為硝酸銨(占到90%以上)，其余非爆炸成分包括有碳質燃料組分、油包水乳化劑、敏化劑、柴油等。所以在爆炸殘留物中只檢測硝酸銨是不能判斷炸藥的種類的，如能夠檢測到這些非爆炸成分，便能夠為公安部門提供更好的線索和依據。

　　國內外研究現狀

　　目前對炸藥的研究主要分為兩大方面，一是爆炸前對炸藥的探測；二是爆炸殘留物分析方法的研究。其中分析方法包括有化學方法和色譜方法這兩大類。其中化學方法主要為操作簡單的點滴反映法和顯色法這兩種，該方法易收到環境的干擾。

　　色譜方法則被認為是鑒定爆炸殘留物最為常用的方法，包括有氣相色譜、液相色譜、離子色譜和質譜法。如果能從爆炸殘留物中分離出各組分的成分，從而便能判定出爆炸物的種類。目前，對工業炸藥的研究集中在其主要成分硝酸銨的檢測上，對非炸藥成分的分析鮮有報道。

 

　　研究工作

　　田老師指出其研究工作重點為炸藥種類的識別及其溯源。其中種類識別主要依據非炸藥成分之間的差異，溯源研究即為從對爆炸殘留物的檢測鑒定出爆炸物的原料成分。田老師的研究工作分為兩大部分，第一大部分為對收集到的77種工業炸藥中的非炸藥成分進行分析，從而得到各種炸藥的特征成分；第二大部分為模擬爆炸現場，找到爆炸殘留物的特征與爆炸物之間的特征進行比對分析，實現溯源的研究，從而驗證該實驗方法的可行性。

　　炸藥中常用的非炸藥成分主要包括碳質燃料組分(石蠟、地蠟、混合蠟、柴油、松香)和乳化劑，通過對非炸藥組分的檢驗可以實現炸藥種類的識別。從常見碳質燃料的氣相色譜質譜圖上可以看到，石蠟、地蠟、混合蠟、柴油的色譜特征都是一系列成高低分布的正構烷烴，松香的特征成分為單萜類物質和樹脂酸。

　　結合上述碳質燃料的分析結果，田老師對77種工業炸藥的碳質燃料進行分析，結果發現銨銻炸藥中的碳質燃料屬于蠟類，銨油炸藥的碳質燃料屬于柴油，粉狀乳化炸藥的碳質燃料屬于松香和蠟類、乳狀乳化炸藥的碳質燃料屬于蠟類。以上這幾類炸藥中的碳質燃料成分十分相近，因此不能作為個體識別的依據。

　　乳狀乳化炸藥的個體識別

　　接下來，田老師繼續對乳化劑Span-80進行分析，乳化劑Span-80是乳化炸藥的關鍵組分，它是由山梨醇失水生成山梨醇酐，再與油酸發生酯化反應生成的混合物。通過乳化劑Span-80的電噴霧質譜圖可以看到，乳化劑Span-80名義上是山梨醇酐單油酸酯，但實際上含有單酯、雙酯、三酯及未反應完全的油酸、山梨醇酐及其同分異構體組成。乳化劑Span-80屬于非離子型表面活性劑，不能直接采用氣質聯用的方法進行檢測。于是，田老師對這些單酯、雙酯及其同分異構體進行酯化反應，使其生成山梨醇和一些易于進行氣質聯用儀檢測的油酸甲酯類物質。

　　從乳化劑Span-80酯交換衍生產物的GC/MS圖中得到，該產物不僅含有硫酸甲酯還包括亞硫酸甲酯和蠟類，并且不同品牌之間的乳化劑Span-80的酯交換衍生產物的相對含量存在很大的差異，因此可以根據這些差異作為乳化炸藥個體識別的依據。田老師通過酯交換GC/MS方法對24種乳化炸藥進行了分析，根據乳化炸藥中乳化劑酯交換衍生產物相對含量的差異，從而實現了24種乳化炸藥的個體識別。該方法為研究乳狀乳化炸藥殘留物的種類識別提供了理論依據。

 

　　乳狀乳化炸藥的溯源研究

　　田老師采用GC/MS方法對空白塵土和乳化炸藥的酯交換衍生產物進行分析，發現在空白塵土中也檢測出硫酸甲酯，即存在很大的環境干擾，經分析得知環境中常見的一些油脂及動植物的殘骸通過酯交換衍生也能生成油酸甲酯等物質，說明該方法不適合復雜爆炸殘留物中乳化炸藥的分析。

　　乳化劑Span-80通過酯交換主要生成油酸甲酯和山梨醇，而環境中很少存在山梨醇的干擾，因此田老師希望通過對山梨醇的分析，來實現乳狀乳化炸藥的溯源。首先對山梨醇進行乙酰化和硅烷化衍生處理，得到其衍生產物，希望建立一種選擇性好、靈敏度高、適合復雜殘留物中痕量乳化劑的分析方法。

　　酯交換乙酰化衍生方法

　　乳化劑Span-80酯交換、乙酰化的衍生產物包括1,4,3,6山梨醇乙酸酯、1,4山梨醇乙酸酯和1,5山梨醇乙酸酯及其同分異構體，以及山梨醇乙酸酯、油酸甲酯等成分。但從山梨醇乙酰化的質譜圖中看到，上述這些衍生產物的碎片信息較少且靈敏度低，因此不適合檢測復雜基質中的痕量乳化劑。

　　酯交換硅烷化衍生方法

　　乳化劑Span-80經過酯交換、硅烷化衍生處理之后，產物包括1,4,3,6山梨醇硅烷酯、1,4山梨醇硅烷酯和1,5山梨醇硅烷酯及其同分異構體，以及山梨醇硅烷酯、油酸甲酯、油酸硅烷酯等成分。同樣，從山梨醇硅烷化的質譜圖中看到碎片離子信息強，適合采用GC/MS聯用和離子模式進行檢測。

　　從空白塵土與乳化炸藥酯交換、硅烷化衍生產物的GC-MS-SIM的色譜圖中發現，乳化炸藥的特征成分為1,4,3,6山梨醇硅烷酯、1,4山梨醇硅烷酯、1,5山梨醇硅烷酯及其同分異構體，以及山梨醇硅烷酯、油酸甲酯、油酸硅烷酯。而在空白塵土中僅僅檢測到硫酸甲酯的成分，沒有任何源于山梨醇硅烷酯的成分在內，從而驗證環境中不存在山梨醇硅烷酯的干擾，因此選定該產物作為乳化炸藥鑒定的依據。接下來，田老師為提高檢測靈敏度，采用SIM模式對山梨醇硅烷酯進行檢測，在不同藥量的殘留物種均檢測到較大強度的山梨醇硅烷酯類物質，從而實現了溯源。

　　研究結果系顯示乳化劑經過酯交換、硅烷化衍生得到的衍生產物具有靈敏度高、選擇性強的優點，且能排除環境的干擾；在乳化炸藥原藥及其300g、600g藥量殘留物中均檢測到山梨醇硅烷酯、油酸甲酯和復合蠟等特征成分，能夠實現炸藥的溯源，也驗證了該方法的可行性，為炸藥種類的溯源判定提供了有力的科學依據。

　　本網收錄前沿Lab：北京師范大學分析測試中心

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液相色譜的基礎

AB公司 趙貴平博士

　　AB公司的趙貴平博士從液相色譜的基礎知識、實驗技術、色譜柱的選擇、色譜柱的使用及保養、方法開發5個方面介紹了液相色譜。趙博士的報告對于色譜的初學者是一次很好的知識普及，對于色譜的使用者則是一次經驗的共享。

　　基礎知識介紹

　　趙博士介紹，色譜作為一種常用的分離方式，20世紀30年代開始廣泛應用和研究。液相色譜的發展經歷了柱色譜、紙色譜、薄層色譜發展到高效液相色譜的歷程。高效液相色譜是一種區別于經典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段，具有高性能色譜柱、高精度輸液泵、高靈敏度檢測器… 但是，無論在技術上，理論上，還是在應用上仍處于發展階段。

　　如果要開發液相色譜方法，需要考慮因素主要因素就是分離度，其次還應該考慮靈敏度、載樣量、分析速度、溶劑損耗，再次需要考慮成本、操作性、色譜柱壽命、效率。

　　液相色譜的結果就是色譜圖，此部分中，趙博士對色譜圖的相關術語也做了介紹。重點介紹了色譜圖常見的問題。這主要涉及色譜峰峰形異常問題(如負峰、寬峰、肩峰、雙峰、峰形不對稱等)和色譜峰保留時間問題(如保留時間不穩定等)兩方面。

 

　　HPLC的實驗技術

　　這部分中，趙博士講了液相色譜實驗中對流動相的要求、流動相的脫氣及保存、色譜泵的運行及保養、樣品預處理、色譜系統管路聯接幾個方面的問題。其中，趙博士重點介紹了流動相的脫氣、色譜系統的管路聯接以及故障與排除三個方面：

　　1)流動相的脫氣

　　流動相脫氣的目的是為了使色譜泵的輸液準確脈動減小，保留時間及色譜峰面積的重現性提高。

　　2)色譜系統的管路連接

　　管路連接不恰當會造成柱外(未連接色譜柱)譜帶擴展，色譜峰之所以表現為譜帶就是由于擴散造成的。影響譜帶擴展的因素有進樣體積、進樣器(密封問題)、連接管路、進樣器到色譜柱、色譜柱到檢測器、接頭和篩板、檢測器體積、以及色譜柱的填料空隙和篩板堵塞等。

　　3)判斷故障與故障排除的原則

　　規則一∶確認問題至少發生兩次以上。如果問題不重復出現，很難證實其確實存在。

　　規則二∶從最簡單的因素入手。

　　規則三∶一次只變化一個因素，以使你能夠確認所變因素與問題之間的關聯。

　　規則四∶恢復原狀，如果使用更換組件方法來查找問題之所在,完畢后應將原有完好組件安裝回原處。

　　否則，換下的組件將來很難再利用,會造成浪費。

　　規則五∶養成記錄的好習慣。一個好記錄是成功地進行故障排除的關鍵。

 

　　液相色譜柱的選擇

　　趙博士講到，選擇液相色譜柱即為選擇填料。具體與填料的粒徑、鍵合化學、填料的含碳量、硅膠的活性有關。

　　填料顆粒度越小，柱效越高(傳質好，渦流擴散小)、柱壓越高(滲透性差)；顆粒分布越寬，柱效低(滲透性差)；球型顆粒柱效高、重現性好、柱床結構均勻，無定型顆粒柱床結構不均勻，流動相線性速度不勻、流動相線性速度不均勻、譜帶擴展。

　　不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同，可能導致色譜的分離機理不同。

　　高含碳量有利于不易保留的化合物的分離，水解穩定性好，重現性好，有利于極性化合物的拖尾改善；低含碳量有利于分析中性及堿性化合物，降低溶劑損耗。

　　硅膠活性的不同是由于生產硅膠時處理溫度不同造成的，這是選擇性差異的主要來源；硅膠的雜質含量是色譜柱質量好壞的重要標志，重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小。

 

　　液相色譜柱的使用及保養

　　趙博士介紹，拿到一根新色譜柱時，要先測柱效，這是良好的色譜實驗習慣。還要保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件。此外，還應定期檢測柱效和儀器的譜帶展寬。趙博士同時提醒大家，對于一根從未用過的色譜柱時，一定要先看其使用說明!

　　對于反相色譜柱，當使用純水溶液流動相是，會出現不保留分離組分的“疏水塌陷”現象。

　　想要解決這一問題，趙博士介紹了相應的對策：對于一般的C18或C8反相柱，應盡量避免；使用純水溶液流動相時，修復已出現疏水塌陷的反相柱，須先用純水洗凈柱中的水溶性緩沖鹽，再用純甲醇小流速浸潤色譜柱。

 

　　液相色譜方法開發

　　這部分中，趙博士就液相色譜新方法的開發與大家進行了交流。要開發一個新的色譜方法，應該從參考文獻方法或執行法規方法、選擇色譜柱、梯度方法初步三個方面考慮。

　　第一步就是要想辦法得到各種信息，可以通過以下途徑：向同行了解是否做過此類樣品，或有否類似樣品的分析方法；查文獻，如CA等。其次，是要對色譜柱有足夠的了解，即掌握分離機理，充分了解要分析測定的樣品及基質。

　　色譜柱是開發液相色譜方法的基礎，色譜柱種類繁多，性能各異，趙博士表示，只有選擇性不同的色譜柱，沒有所謂的壞色譜柱。選擇色譜柱的首要原則是適用于分析對象,因為，沒有萬能的色譜柱!

　　梯度洗脫可以增加單位時間的分離能力，提高檢測靈敏度。但是，這對儀器設備要求高，且色譜柱需再生，定量分析的重復性較低。

梯度洗脫的方式

　　報告下載：液相色譜基礎