第二十五期質譜沙龍活動報道分析測試百科網wiki版

發布時間：2010-01-27 13:53 原文鏈接：第二十五期質譜沙龍活動報道

【導語】大氣壓下離子化技術曾獲得2002年的Nobel化學獎，今日，它是否可以讓我們跟溶劑、液相色譜、梯度條件這些詞匯說拜拜，實現快速、實時、綠色的質譜分析？用LC-MS/MS方法測定全譜氨基酸，是否可以讓我們更快速地檢測患者的疑難雜癥？雙梯度液相會給我們帶來什么好處？請關注下文詳細報道……

　　2010年1月23日下午，2010年度第一期(總第二十五期)質譜沙龍活動在解放軍第二炮兵總醫院藥劑科舉行。參加本次活動的除了有來自中國食品工業發酵研究院、第二炮兵總醫院、AB公司、軍事醫學科學院、中科院動物研究所、中科院過程工程所、協和醫院的老朋友外，還有來自廈門大學、ASPEC華柏生物科技有限公司、戴安公司的新朋友。與往期不同的是，本期活動增加了液相色譜的內容。

　　第二十四期質譜沙龍活動現場

　　直接實時分析：升級你的LCMS

　　ASPEC華柏生物科技有限公司的首席技術官劉春勝博士

　　首先，ASPEC華柏生物科技有限公司的首席技術官劉春勝博士為大家帶來了報告“直接實時分析(Direct Analysis in Real Time，DART?)：升級你的LCMS”。

　　為什么要升級你的LCMS?

　　劉博士以發問的方式開始了他的報告——為什么要升級你的LCMS?

　　LCMS接口技術經歷了ESI、APCI、微/納噴霧等歷程，它的理念是快速、簡單，至今已被廣泛應用于多種應用領域。盡管LCMS具有可定性定量、選擇性與專屬性(分辨率和質譜精度)高、靈敏度高(可達pg甚至fg級)、響應范圍寬、分析速度快、經久耐用、自動化程度高等優點；但也面臨著以下挑戰：

　　1)溶液狀態可能使樣本降解、發生反應；

　　2) 需要耗費時間和人力的樣品制備過程；

　　3) 存在離子抑制效應，會降低檢測降低靈敏度，比如ESI源中無機鹽/非揮發性鹽對樣品信號的嚴重抑制；

　　4) 需要專家操作(人力成本高)、維護成本高(比如今日的乙睛價格非常高昂，而處理大量的廢液也會使成本增加)；

　　5) 分析速度還不夠快，通常的LCMS從接樣到出結果約需3~4小時，但使用者希望幾分鐘就可以出結果。

　　明天的生物學對速度的要求，是希望幾分鐘就能出結果，從而實時地支持臨床治療；而綠色化學的要求，希望耗費小流量的溶劑甚至是——無需溶劑。那么，什么可以做到快速和綠色化學呢？答案是——DART? ！

　　DART的原理

　　DART?是一種非接觸的表面采樣技術，用于室溫和大氣壓下的解析電離質譜，是一種“開放式的直接探針”。可以檢測分析揮發性或不揮發材料，也可用于分析氣體、液體、固體和材料表面。該技術是一種無損耗的分離、離子化和脫附技術，對環境要求不是很苛刻，適合車載和便攜式現場檢測。

　　DART?于2005年由JEOL(日本電子)和IonSense公司聯合商品化，并獲得了當年的匹茲堡金獎和R&D 100創新大獎。

　　DART?的結構示意圖

　　DART?的原理是：載氣（第一代DART?為氦氣，價格較高；第二代為氮氣，可以加熱）被引入腔體，在3 ~ 5KV的放電針下產生等離子體，透鏡將帶電粒子轉移，電極柵/氣孔可以阻止離子與離子間的二次結合。出來的等離子體打在樣品表面，和樣品發生能量轉移、質子轉移、電子捕獲等作用，從而產生樣品離子后進入質譜，分析過程類似APCI源。整個過程沒有暴露的高壓，保證了安全性，且在室溫下即可操作。使用者也可幾分鐘拆下自己的ESI源，換上DART。

　　DART的優點和用途

　　劉博士介紹，DART?的優點在于快速即時地離子化固體、液體和氣體；無需樣品制備；質量范圍達2000Da；幾乎可以和所有商品化的質譜聯用。DART?使得質譜簡化，對未知物的分析更容易。DART?不會形成鈉、鉀的加合物，離子信號更簡單直接；DART?也不會產生多電荷離子，不存在離子抑制效應，即使對很臟的尿樣也可以分析，即可以分析原型樣本。DART?幾乎可以和所有商品化的MS聯用（除島津的質譜），如DART?-Waters ZQ、DART?-Thermo LCQ、DART?-API 3000/4000 /100。在靈敏度方面，有人曾試驗用DART?與API 3000連接，與API 4000做同一樣本的靈敏度接近。

　　DART?目前有幾種型號：

　　1) DART?100，這是最早期的DART?產品，具備最基礎的DART?功能；

　　2) DART?-ET，該技術加大了樣品分析的空間，滿足樣品量大和來源多樣性的要求；

　　3) DART?SVP，該技術09年剛推出，是一種用iPOD touch操控的智能化技術，可以全面操控DART源的各種參數和分析過程；并可從網站下載各種參考方法、樣品譜庫，可適用于便攜分析場合。

　　另外，DART?還可使用分析大量樣品的Auto DART?-96、化學噪音更低的Dip-it?采樣技術、可以捕獲更多氣化離子的Vapur?技術，其中Vapur專利技術，可以把DART產生的離子通過長距離的傳輸線傳入質譜，并保證信號靈敏度，對于安檢、法醫、應急檢測非常有用。

　　劉博士舉例了DART?分析的多種應用，包括藥品、代謝組學、爆炸物、有機合成和有機代謝、食品和飲品、毒性工業材料、殺蟲劑、低聚糖、包裝和聚合物，總之，除了蛋白質的所有物質均可用DART?分析（注：蛋白等可用DESI源，但DESI源目前尚沒有成熟的商品化儀器）。與LC相比，DART?的條件更簡單，過程控制更能反映真實情況。DART?最重要的特點就是可對LC無法分析的膏狀物、糖漿以及尼龍樣、膠水、粘合劑等高聚物進行分析，雖然裂解質譜也可以分析高聚物，但DART?對樣本是沒有損耗的。

　　DART?定性分析的原理與LC/MS相同，可以用Q-Trap、Orbit-Trap、FT分析，iTouch可下載的譜庫中包含23,000個天然產物和800多個農殘譜圖。DART?也可用于定量分析，比如用氘代內標定量法，線性范圍在3個9以上。在使用簡單性方面，iTouch已充分地實現人性化，比如用紅綠燈顯示農殘是否超標，這甚至使家庭主婦也可以方便地使用DART。

　　報告最后，劉博士總結到，DART?自2005年發明以來，DART?-MS作為一種嶄新的質譜分析技術被廣泛地應用于藥物發現與開發、食品安全檢測、司法鑒定、材料分析及相關化學和生物化學分析等領域。

　　相比于現行通用的LC-MS技術，DART?-MS分析將不再需要繁雜的樣品制備技術和耗時的色譜分離。作為一種“綠色”分析檢測技術，DART?-MS將急劇縮短樣品分析周期，極大地減少對化學溶劑的消耗和對固定資產和人員的投資。

　　對于DART新型離子源技術，在座者均表示出濃厚的興趣，和劉博士展開了熱烈的討論。

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　　人體LC-MS/MS全譜氨基酸檢測技術及醫院工作中的應用

　　解放軍第二炮兵總醫院藥學部李鵬飛老師

　　解放軍第二炮兵總醫院藥學部的李鵬飛老師為大家帶來了報告“人體LC-MS/MS全譜氨基酸檢測技術及醫院工作中的應用”。李老師首先舉了一位患者氨基酸檢測的實例，來闡明他們檢測觀念的轉變——從以檢測技術為核心轉變為以患者為核心，即從為了追求更好的數據轉而為滿足患者的需求進行檢測。

　　接下來，李老師介紹了下列幾個方面的內容：

　　一、研究背景與氨基酸檢測的意義

　　人體內包含很多氨基酸，重要的有40余種，我們稱之為全譜氨基酸(The Full Spectrum of Amino Acids)。全譜氨基酸在體內是一個動態的平衡。這一平衡打破，是很多疾病的誘因或表現形式。

　　目前，氨基酸代謝障礙所引起的疾病已超過100多種，稱作氨基酸代謝病。氨基酸代謝病即氨基酸病，或稱為氨基酸尿癥(aminoaciduria)。

　　李老師從兩方面總結了氨基酸與疾病的關系。一方面，如果患者患有某種疾病，某些氨基酸升高，通過檢測氨基酸水平就可以表示這種疾病，那么這類氨基酸就可作為該疾病的生物標記物，也可進一步建立疾病診斷的標準;另一方面，如果氨基酸是疾病的誘因，氨基酸的升高或降低導致了疾病的產生，那么可以這幾種氨基酸為切入點，進行治療。

　　目前，主流的氨基酸檢測方法有以下幾種：

　　1) 自動氨基酸分析儀：該方法檢測靈敏度低，檢測種類有限，但檢測成本低、方法固定;

　　2) HPLC：靈敏度較高，但對于同分異構氨基酸和痕量氨基酸分離效果不是很好;

　　3) 串聯質譜儀(LC-MS/MS)：這是一項比較新的檢測技術，具有檢測范圍寬、精確定量(獨立的同位素內標)、速度快(25分鐘分析一個樣本、可以分析復雜樣本(血液、土壤、蛋白水解液)的特點。

　　二、全譜氨基酸檢測與分析系統的開發

　　李老師介紹，全譜氨基酸的檢測和分析借鑒了“同位素標記的蛋白質組定量方法”，選用內標法。具體的原理，可參見：質譜沙龍第十三期報道之——人體內45種氨基酸定量檢測和腸內外營養

　　和第七期報道之——準確的定量和快速篩查方法：用LC/MS/MS做臨床氨基酸測定

　　本次報告報道的氨基酸樣品前處理和分析流程如下圖所示：

氨基酸樣本前處理流程

　　實驗結果表明：

　　1. 總離子流譜圖中有80多個色譜峰，同時定量了40多個氨基酸。通常一個分析時間25min，出峰完全是12min，之后是梯度再平衡。結果表明：分辨率較高，可以實現較好的分離。

　　2. 內標定量結果表明了定量的原理，從圖中可以看到，每個氨基酸均對應于內標，因此譜峰是一對一對出現的，由于只是同位素的差異，而同位素差異對前處理行為、色譜行為和離子化行為沒有影響，這樣就可以通過質譜行為的差異區分兩個峰，通過已知濃度定量未知濃度。本方法中采用的是114標定標準品，115標定樣品。

　　3. 高分離度結果：通過使用很平緩的高取向柱子做一個長梯度，最后做一個循環來做到高分辨。

　　4. 從工作站自動生成的單個氨基酸圖譜報告中看到，對每個氨基酸均可得到一個對應樣本譜峰、內標譜峰以及最終的準確的濃度信息。

　　這部分的最后，李老師總結了引進的串聯質譜檢測全譜氨基酸方法的優勢：1) 高通量，25min即可檢測一個樣本;2)每個氨基酸都有自己的獨立同位素內標，可以精確定量，嚴格區分同分異構體，靈敏度大pmol級;3)能夠同時分析復雜基質中42個氨基酸，為臨床、科研、保健品和藥品開發提供全面信息。

　　三、臨床應用及課題拓展

　　本部分李老師講解了在引進方法的基礎上進行的拓展——全譜氨基酸代謝組學分析系統。該系統可以給出比較直觀的檢測報告，不僅檢測結果一目了然，還可以歸納出出一些結論。檢測的氨基酸為42種，系統按照生理機能等因素將結果分為以下五大類：必需氨基酸-10種、神經內分泌相關、氨能量代謝相關、硫代謝相關、附加代謝物。

　　此外，系統還可給出分析報告，包括：

　　1)單個氨基酸分析，對每個結果異常的檢測項都做了詳細的解釋。包括參考上下限、基本介紹、營養健康評估、營養補充調節建議、營養干預因子、體內詳細代謝圖譜。

　　2)多指標/特殊指標分析，氨基酸在體內是一個動態的平衡體系，很多氨基酸是相互關聯的，通過對相關氨基酸的數據分析，可以得到更多的信息。

　　3)適合普通體檢的健康分析，從十三個健康系統中選擇與某一健康系統相關的氨基酸，對其進行權重加和，以正態分布為參考，考察體檢者該健康體系的狀態。

　　4)干預調節，這是軟件自動生成的一種干預，系統對代謝紊亂的受檢者提供2項干預指導，一是必需氨基酸的補充建議，另一是常見的藥物干擾。

　　5)醫師、營養師建議。

　　最后，李老師對全譜氨基酸檢測進行了展望。李老師還將進行“全譜氨基酸檢測技術指導腎病干預試驗”和“LC-MS/MS全譜氨基酸檢測技術指導建立糖尿病風險篩查模型及初步的營養學評價”方面的研究。圍繞《全譜氨基酸代謝組學分析系統》開展臨床檢測，全面深入開展臨床服務;尋找新的生物標志物，開展臨床驗證，建立LC-MS/MS法診斷標準;探索氨基酸檢測在軍事領域的應用，為軍事醫學服務;全方位開展對外檢測報務。其中，通過氨基酸水平評價亞健康狀態和區域性疾病正在申報課題。

　　報告下載：人體LC-MSMS全譜氨基酸檢測技術及醫院工作中的應用

　　本網收錄前沿Lab：第二炮兵總醫院分析中心

　　戴安公司雙梯度液相色譜及其應用

　　戴安公司液相色譜應用工程師趙秀苔老師

　　戴安公司的液相色譜應用工程師趙秀苔老師向大家介紹了“戴安公司雙梯度液相色譜及其應用”。趙老師介紹，戴安公司擁有從納升級液相色譜、常規液相色譜到半制備級液相色譜全面的高效液相色譜級別。此外，戴安公司還生產常規、超高效、生化液相色譜柱。智能化的液相色譜有變色龍色譜網絡軟件支持，可控制大約30 個生產廠家的近300 種的色譜部件。

　　戴安公司的UltiMate3000系列液相色譜有緊湊系統、標準系統、鈦系統、超高速液相色譜(RSLC)、x2雙梯度液相色譜系統(DGLC)。其中，趙老師主要介紹了DGLC。DGLC的模塊及其功能如下圖所示。

　　DGLC模塊及功能

　　DGLC有不同的配置可供用戶選擇，如微流速系統DGP3600M和超高效(U-HPLC)雙梯度液相色譜系統DGP3600RS等。DGLC可以為用戶解決以下問題：

　　1) 快速分析：即在不改變已經經過認證的方法的前提下，提高分析速度。包括節省梯度平衡的沖洗時間、提高梯度方法的速度的串聯(Tandem)色譜以及對任何方法都能通過共享色譜泵、自動進樣器和柱溫箱來提高一倍分析速度的并聯(Parallel)色譜。

　　2) 不同應用之間的快速切換：一臺儀器同時為兩種應用做準備，連續不間斷運行兩個不同應用。

　　3) 多維分離：即通過2D 或3D 提高分離度，多用于生化及蛋白質組學領域，目前主要集中在微柱、毛細管柱及納升柱，也包括今年流行的“全自動離線”多維色譜。

　　4) 樣品的在線(On-Line)前處理：集成的SPE 小柱可提高自動化程度，還可以直接分析血樣、食品樣等較臟的樣品。

　　5) 提高質譜靈敏度：體現在在線快速脫鹽、使用左泵作為輔助泵以及通過柱后交換流動相增加揮發性有機溶劑比例、調節pH值、或添加輔助試劑以提高質譜的響應值。

　　6) 柱后衍生;將第二個泵作為柱后衍生泵。

　　7) 兼容性：可兼容任何現有的HPLC 系統。

　　接下來，趙老師戴安公司的幾種智能化質譜解決方案：

　　1. 串聯液相色譜

　　串聯液相有兩個流路，色譜柱在兩個流路間切換，即再平衡過程中直接用柱切換閥切換至圖中左面的泵進行再平衡和清洗，在運行周期中省去了沖洗及平衡色譜柱的時間。

　　2. 并聯液相色譜

　　并聯液相相當于兩套獨立的流路，共享一個自動進樣器和柱溫箱。并聯液相通過變色龍軟件將其配置為兩套系統，可運行不同應用程序下的兩套樣品。

　　為了進一步說明上述解決方案的特點，趙老師舉了環境中爆炸物殘留的分析的應用實例。

　　爆炸殘留物的分析在軍事演習現場及周圍環境評價、犯罪及恐怖襲擊案件的偵破中都有重要的意義。EPAMethod8330是檢測環境中爆炸殘留物最常用的方法，該方法中規定了14種需要監測的爆炸物，建議用一種色譜柱(如：C18柱)作為主要的分析柱分離這些化合物;并建議用另外一種選擇性有差異的反相柱作為補充確認(如：CN柱)。14種化合物都要被分離(而2006年新的8330B需要分析多達17種)，并在分析后盡可能快地確認。用普通C18及CN很難滿足上述要求。Dionex的專用色譜柱(Acclaim Explosive E1 及E2 色譜柱)可以一次分離全部14 個所要求的物質。E1 及E2 有不同的選擇性。如果用并聯液相色譜系統，可用E1 分析、E2 確認，大大提高了檢測通量。

　　3. 兩維色譜(2D色譜)

　　2D色譜結合使用兩種不同選擇性的色譜柱，極大程度地提高了峰容量和分離選擇性。2D色譜有在線(on-line)和離線(off-line)兩種。

　　off-line 2D色譜是一種可以極大提高復雜混合物分離度的簡單、快速的方式。此方法最具優勢的地方是一維和二維之有濃縮富集的應用。此方法不適合定量分析，但是，如果樣品的熱穩定性好，提高自動進樣器溫度使流動相揮干再定容就可以克服這一點。用變色龍軟件可編輯自動進樣器程序。

　　on-line 2D色譜適宜應用于簡單體系，它提供一個快速、方便的常規不純物的分析。密閉體系，避免樣品丟失以及降解，可用于定量分析。

　　4. 在線固相萃取/ 濃縮(On-Line SPE)技術

　　On-Line SPE技術具有以下特點：減低手工操作需求、節約時間;重現性高;方便于直接進樣;更快、更經濟;可以自動化;無人照管操作過夜或過周末;減少接觸對人體有害物質的機會。該技術廣泛應用于食品及飲料分析實驗室、環保實驗室和制藥及臨床實驗室。On-Line SPE檢測方法可借助變色龍軟件進行開發。