在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。