試劑、試劑盒 封閉緩沖液氯仿IPTG抗原-抗體復合物檢測試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩沖液放射性碘標記第二抗體第一抗體LB 瓊脂板LB 頂層瓊脂板硝酸纖維素濾膜λ噬菌體表達文庫E.coli
儀器、耗材 預設 42°C 的空氣培養箱培養管平頭鑷子裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器
實驗步驟
材料
緩沖液
貯存液、緩沖液及試劑的組分請見附錄 1, 貯存液稀釋至含適濃度。
封閉緩沖液
10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
另外，也可用 5%(V/V) 脫脂奶粉或含 1% 明膠 (m/V) 和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液作封閉緩沖液。至于哪種試劑最好，不同實驗室各執一辭。建議研究者通過預實驗來決定最佳選擇。封閉緩沖液于 4°C 保存，可反復使用數次。洧液中加入終濃度為 0.05% 的疊氮化鈉抑制微生物的生長。
氯仿
IPTG(10 mmol/L)
步驟 4 前，溶解 0.6 g 固體 IPTG 子 250 ml 水中。通過 0.25um 濾膜滅菌處理。
抗原-抗體復合物檢測試劑：
堿性磷酸酶 (AP) 偶聯抗體進行生色反應篩選試劑
辣根過氧化物酶（HRP) 偶聯抗體進行生色篩選試劑
化學發光篩選試劑
每種篩選方法所用的試劑，請見步驟 15, 關于檢測抗體的常用方法，請見本章末信息欄中用抗體進行免疫篩選相關內容。詳情請見附錄 9。
SM
室溫下保存 50 ml 等份 SM. 用后丟棄以免污染。
TNT 緩沖液
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
每篩選 10 張濾膜需大約 1 升 TNT 緩沖液。室溫保存。
洗洚緩沖液：
含 0.1%(m/V) 牛血淸白蛋白的 TNT 緩沖液
含 0.1%(m/V) 牛血濤白蛋白和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 緩沖液
這些緩沖液不含疊氮化鈉
放射性化合物
125I 標記的蛋白質 A 或 125I 標記的免疫球蛋白（可任選）
放射性碘標記第二抗體
若用步驟 15 中放射性標記第二抗體來檢測抗原-抗體復合物時可用此種抗體。
抗體
第一抗體
對于第一第二抗體的選擇，參見本章末信息欄利用抗體進行免疫篩選相關內容。
培養基
LB 瓊脂板
90mmPetri 平皿中應放有 30~35 ml 瓊脂培養基，150 mm 板上則要有約 50 ml。平板必須干燥，否則，當硝酸纖維素濾膜移走時，上層瓊脂糖會剝離。通常把兩天前鋪制的平板稍微打開蓋放于 37°C 繼續干燥 1~2 h, 效果很好，篩選過程中應使用不含氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板，因為大腸桿菌 Y1090 hsdR 在抗生素存在下生長緩慢。
LB 頂層瓊脂板
將頂層瓊脂于微波爐短時間融化，冷卻至 47°C, 將其分成 3 ml 等份小樣（用于 90 mm 平板）或 7.5 ml 等份小樣（用于 150 mm 平板)，置于無菌管中，將這些等份樣置于 47°C 干浴或水浴中以防凝固。
專用設備
預設 42°C 的空氣培養箱
培養管（無菌 13 mmX100 mm）
平頭鑷子
裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器
硝酸纖維素濾膜
適用于結合蛋白及免疫印記反應的濾膜有不含 Triton-X100 的硝酸纖維素濾膜（Millipore HATF 或相當產品）及硝酸纖維素衍生物如 Hybond-Cextra (Amersham Pharmacia Biotech 公可)，尼龍膜或帶極性尼龍膜因為背景較高及固定蛋白質能力弱不適用于免疫篩選。
用軟鉛筆或圓柱珠筆在濾膜上作好記號，用水打濕，夾于干燥 Whatman3 MM 濾紙之間，用鋁箔將一疊濾紙包好，10psi(0.70 kg/cm2) 高壓蒸汽滅菌。
附加試劑
本方案步驟 1 需第 2 章方案 1 列出的試劑。
本方案步驟 17 需第 2 章方案 1 列出的試劑。
載體及細菌株
λ噬菌體表達文庫
可按第 11 章所述利用合適表達載體構建 cDNA 文庫，亦可從供應商處購得，開始實驗前，應按第 2 章方案 1 中所述確定噬苗體溶液的效價。
E.coli
采用不同宿主菌株進行篩選則需要不同培養基，例如：E.coli Y1090 hsdR，常可用做 λgtll 構建的 cDNA 文庫的宿主菌，它在編碼 ATP 依賴性蛋白酶的基因上攜帶一個突變在這種菌株表達的融合蛋白比在沒有這種突變的菌株中更穩定。這種菌株還攜帶 pMC9 質粒，編碼 lac 阻遏蛋白，防止β-半乳糖苷酶啟動子啟動細胞毒性融合蛋白的合成。9pMC9 質粒還攜帶選擇標志（amp）, 保證不使質粒丟失。E.coli Y1090 hsdR 菌株應在含 50ug/ml 氨芐青霉素的培養基中生長（篩選除外，請見上述關于 LB 瓊脂平板的注釋）。對于λZAP 及其衍生物構建的文庫，則用 E.coli BB4 和 XL1-Blue 菌株進行免疫篩選。此株在 F‘因子上攜有 lacl 基因和四環素抗性標記（tet)。這類菌株應在含 12.5ug/ml 四環素的培養基中生長。
在應用這些宿主菌前，應熟悉其基因型及任何特殊的生長要求。