| 實驗步驟 | 材料
緩沖液
貯存液、緩沖液及試劑的組分請見附錄 1, 貯存液稀釋至含適濃度。
封閉緩沖液
10mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
150 mmol/L NaCl
0.05%(V/V) Tween-20
20%(V/V) 胎牛血淸
另外，也可用 5%(V/V) 脫脂奶粉或含 1% 明膠 (m/V) 和 3%(m/V) 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液作封閉緩沖液。至于哪種試劑最好，不同實驗室各執一辭。建議研究者通過預實驗來決定最佳選擇。封閉緩沖液于 4°C 保存，可反復使用數次。洧液中加入終濃度為 0.05% 的疊氮化鈉抑制微生物的生長。
氯仿
IPTG(10 mmol/L)
步驟 4 前，溶解 0.6 g 固體 IPTG 子 250 ml 水中。通過 0.25um 濾膜滅菌處理。
抗原-抗體復合物檢測試劑：
堿性磷酸酶 (AP) 偶聯抗體進行生色反應篩選試劑
辣根過氧化物酶（HRP) 偶聯抗體進行生色篩選試劑
化學發光篩選試劑
每種篩選方法所用的試劑，請見步驟 15, 關于檢測抗體的常用方法，請見本章末信息欄中用抗體進行免疫篩選相關內容。詳情請見附錄 9。
SM
室溫下保存 50 ml 等份 SM. 用后丟棄以免污染。
TNT 緩沖液
10 mmol/LTris-Cl(pH8.0)
150 mmol/LNaCl
0.05%(V/V)Tween-20
每篩選 10 張濾膜需大約 1 升 TNT 緩沖液。室溫保存。
洗洚緩沖液：
含 0.1%(m/V) 牛血淸白蛋白的 TNT 緩沖液
含 0.1%(m/V) 牛血濤白蛋白和 0.1%(V/V)NP-40 的 TNT 緩沖液
這些緩沖液不含疊氮化鈉
放射性化合物
125I 標記的蛋白質 A 或 125I 標記的免疫球蛋白（可任選）
放射性碘標記第二抗體
若用步驟 15 中放射性標記第二抗體來檢測抗原-抗體復合物時可用此種抗體。
抗體
第一抗體
對于第一第二抗體的選擇，參見本章末信息欄利用抗體進行免疫篩選相關內容。
培養基
LB 瓊脂板
90mmPetri 平皿中應放有 30~35 ml 瓊脂培養基，150 mm 板上則要有約 50 ml。平板必須干燥，否則，當硝酸纖維素濾膜移走時，上層瓊脂糖會剝離。通常把兩天前鋪制的平板稍微打開蓋放于 37°C 繼續干燥 1~2 h, 效果很好，篩選過程中應使用不含氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板，因為大腸桿菌 Y1090 hsdR 在抗生素存在下生長緩慢。
LB 頂層瓊脂板
將頂層瓊脂于微波爐短時間融化，冷卻至 47°C, 將其分成 3 ml 等份小樣（用于 90 mm 平板）或 7.5 ml 等份小樣（用于 150 mm 平板)，置于無菌管中，將這些等份樣置于 47°C 干浴或水浴中以防凝固。
專用設備
預設 42°C 的空氣培養箱
培養管（無菌 13 mmX100 mm）
平頭鑷子
裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器
硝酸纖維素濾膜
適用于結合蛋白及免疫印記反應的濾膜有不含 Triton-X100 的硝酸纖維素濾膜（Millipore HATF 或相當產品）及硝酸纖維素衍生物如 Hybond-Cextra (Amersham Pharmacia Biotech 公可)，尼龍膜或帶極性尼龍膜因為背景較高及固定蛋白質能力弱不適用于免疫篩選。
用軟鉛筆或圓柱珠筆在濾膜上作好記號，用水打濕，夾于干燥 Whatman3 MM 濾紙之間，用鋁箔將一疊濾紙包好，10psi(0.70 kg/cm2) 高壓蒸汽滅菌。
附加試劑
本方案步驟 1 需第 2 章方案 1 列出的試劑。
本方案步驟 17 需第 2 章方案 1 列出的試劑。
載體及細菌株
λ噬菌體表達文庫
可按第 11 章所述利用合適表達載體構建 cDNA 文庫，亦可從供應商處購得，開始實驗前，應按第 2 章方案 1 中所述確定噬苗體溶液的效價。
E.coli
采用不同宿主菌株進行篩選則需要不同培養基，例如：E.coli Y1090 hsdR，常可用做 λgtll 構建的 cDNA 文庫的宿主菌，它在編碼 ATP 依賴性蛋白酶的基因上攜帶一個突變在這種菌株表達的融合蛋白比在沒有這種突變的菌株中更穩定。這種菌株還攜帶 pMC9 質粒，編碼 lac 阻遏蛋白，防止β-半乳糖苷酶啟動子啟動細胞毒性融合蛋白的合成。9pMC9 質粒還攜帶選擇標志（amp）, 保證不使質粒丟失。E.coli Y1090 hsdR 菌株應在含 50ug/ml 氨芐青霉素的培養基中生長（篩選除外，請見上述關于 LB 瓊脂平板的注釋）。對于λZAP 及其衍生物構建的文庫，則用 E.coli BB4 和 XL1-Blue 菌株進行免疫篩選。此株在 F‘因子上攜有 lacl 基因和四環素抗性標記（tet)。這類菌株應在含 12.5ug/ml 四環素的培養基中生長。
在應用這些宿主菌前，應熟悉其基因型及任何特殊的生長要求。
方法
λ噬菌體的平板培養
1. 取適當大腸桿菌菌株的單克隆進行接種，按第 2 章方案 1 介紹的方法制備用于鋪平板的培養細菌。
2. 假定每個 90 mm 平皿和 150 mm 平皿分別可長出 2X104 個和 5X104 個噬菌斑，計算篩選文庫所需平皿數。對應每個平皿準備一個無菌試管（13 mmxl00 mm), 并在試管架上依次排好。各試管分別加入 0.1 ml 用于鋪平板的細菌和 0.1 ml 含所需數量λ噬菌體表達文庫的 SM 溶液，置于 37°C, 溫育 20 min。
噬菌斑密度低時，免疫篩選的軟果最好。噬菌斑的外周邊顯色反應產生的顏色最明顯。因此分離效果好的免疫陽性噬菌斑呈特征性環狀，而分布過于緊密的菌斑則為片狀形態，相鄰噬菌斑之間的共同周邊上顏色強度大大減弱，不過，只要還有部分周邊未與鄰近噬菌斑的用邊相接，就仍可辨別出陽性噬菌斑。當密度超過大約 500 噬菌斑/cm2 時，相鄰的噬菌斑的周邊消失，抗原陽性反應的噬菌斑也就更難分辨。所以，上面給出的每個平板所含噬菌斑數應視為免疫篩選的上限。
3. 各個試管內繼續加入 2.5 ml(90 mm 平皿）或 7.5 ml(150 mm 平皿）融化的頂層瓊脂糖，混勻后立即傾注到 LB 瓊脂板上。凝固后平板于 42°C 溫育 3.5 h。
42°C 溫育是保證λ阻遏蛋白質（clts857 等位基因編碼）失活及λ噬菌體發育過程中裂解程序的活化。
誘導蛋白質的表達
4. 用軟鉛筆或圓珠筆在硝酸纖維素濾膜上編號。手持濾膜時應戴手套，以免皮膚上的油脂影響蛋白質的轉移。濾膜先在異丙基硫代-β-D-半乳糖苷溶液（IPTG,10 mmol/L)中浸泡幾分鐘，再用平頭鑷子（如 Millipore 鑷子）夾出放在一疊 Kimwipes 紙上，于室溫晾干。
5. 從培養箱內取出平板，迅速用浸過 IPTG 的硝酸纖維素濾膜覆蓋表面，與平板接觸后切勿移動濾膜。將平板置于 37°C 溫育，重復數次直至將所有平板都覆蓋硝酸纖維素濾膜。
在平板上放置濾膜而又不藏匿氣泡的最簡易方法是拿住濾膜的邊緣，將它稍微彎曲以使中部先與平板中央接觸，利用吸水作用把濾膜吸在平板上。
將濾膜放于平板時一定要迅速，這樣，平板的溫度不會低于 37°C。在低于 30°C 以下時，λ噬菌體的生長會受到嚴重阻滯。
6. 平板于 37°C 溫育至少 4 h。
初篩文庫時，很難區分免疫反應噬菌斑和假陽性結果。處理濾膜時的小心操作，特定抗血清的性質，抗原抗體復合物的檢測方法等多種因素都會影響假陽性的頻率。一般來說，生色反應比免疫化學反應和化學發光反應的假陽性都要少。不過，即使在最佳條件下，假陽性也將以大約每平板 1 個的頻率出現。為此，我們建議在復印濾膜上進行篩選，以避免二次篩選大批噬菌斑時耗費人力物力。
如果不用復印濾膜進行文庫篩選，原始濾膜可在平扳上放置10~12 h 若需要復印濾膜。請見步驟 9 的相關內容。
7. 掀開平皿上蓋，于 37°C 繼續溫育 20 min, 此步驟可加強軟瓊脂與平板之間的連接。
8. 把平板分批移至室溫，用裝有防水黑墨水并帶有 18 號針頭的注射器，戳穿濾膜直至下面的瓊脂，在至少 3 個不對稱的位置上做出標記。
9. 利用平頭鑷子從平板上剝離濾膜，迅速浸入大量 TNT 緩沖液中，在緩沖液中輕輕攪動濾膜洗去濾膜上殘存的瓊脂糖，并搖動 TNT 以防濾膜彼此粘連。
若大塊瓊脂糖貼在硝酸纖維素濾膜上，則先將平板置于 4°C30 min 或-20°C5 min 預冷，再剝離濾膜。
10. 待所有的濾膜都轉移到 TNT 緩沖液中，用塑料膜將平板包好，4°C 保存，直至得出免疫篩選結果。
表達目的融合蛋白噬菌斑的檢測
重要：下列各步驟切勿使濾膜完全干燥，本來與濕潤濾膜非特異性可逆結合的抗體，一且濾膜變干，就會永久留在濾膜上。另外濾膜浸入各種緩沖液和抗體溶液時要防止它們彼此相連。為此，可把濾膜分批（每批 5 張濾膜)，毎批單用一個大平皿或結晶皿, 這樣就可以減少彼此相連的問題。可將平皿互相疊在一起放在低速轉動的平臺式搖床上。
11. 所有濾膜全部剝離并漂洗后，逐張放在新換的 TNT 中，全部濾膜都轉移完畢后，于室溫繼續溫和攪動緩沖液 30 min。
如有必要，濾膜此時可以從緩沖液中取出，用 Satan 包裝膜包好，于 4°C 保存 24 h。
12. 用平頭鑷子把濾膜逐張轉移至含封閉緩沖液（每張 82 mm 濾膜需 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜需 15 ml) 的玻璃盤中，所有濾膜均浸沒后，室溫下在轉動平臺上慢慢搖動溶液 30 min。
13. 用平頭鑷子把濾膜轉移至含稀釋的第一抗體的封閉緩沖液（每張 82 mm 濾膜需 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜需 15 ml) 的新鮮玻璃盤中，使用產生背景不算很高但仍可檢測 50~100pg 變性抗原的最高抗體稀釋度。所有濾膜均浸沒后，室溫下在轉動平臺上緩慢搖動溶液 30 min。
抗體可 4°C 保存并可反復使用數次。溶液中加入終濃度為 0.05% 的疊氮化鈉抑制微生物的生長。
14. 依次將濾膜放到下列每種緩沖液中洗滌 10 min, 在緩沖液之間轉移濾膜時應逐張進行， 每張 82 mm 各需用緩沖液 7.5 ml; 每張 138 mm 濾膜需 15 ml。
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液
含 0.1% 牛血清白蛋白和 0.1%NP-40(NondidetP-40) 的 TNT 緩沖液
含 0.1% 牛血清白蛋白的 TNT 緩沖液
15. 利用所選擇的放射化學、生色反應或化學發光試劑檢測抗原抗體復合物。
放射化學篩選
每張濾膜需用大約 1uCi 的 125I 標記的 A 蛋白或免疫球蛋白，放射性標記 A 蛋白已商品化（比活 2~100uCi/ug) 放射性碘化的第二抗體可從供應商購得，或按材料前信息欄中 IgG 的放射性碘標記進行制備。
a. 用封閉緩沖液稀釋放射性標記配體（每張 8 mm 濾膜需 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜需 15 ml)。
b. 室溫下溫育 lh, 用 TNT 漂洗數次，按附錄 9 中所述進行放射自顯影。
繼續步驟 16。
生色反應篩選
識別第一抗體種特異性決定簇的辣根過氧化物酶（HRP) 或堿性磷酸酶（AP) 偶聯的抗體可向廠商購買，并按產品說明書推薦的稀釋度及要求使用。一般每張 82 mm 濾膜，可將 5ul 偶聯抗血清加入 7.5ul 封閉緩沖液（無疊氮化鈉）中，要了解 HRP 或 AP 更多內容，請見附錄 9。
聯合應用 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP) 底物及氮藍四唑（NBT) 對抗原-抗體-抗抗體-AP 復合物進行定位
a. 將濾膜放于含 AP-偶聯抗體的溶液中，于室溫下緩慢揺動 1.5~2 h。
b. 按步驟 14 洗滌濾膜。
c. 制備 BCIP(50 mg/ml 溶于 100% 二甲基甲酰胺）和 NBT(50 mg/ml 溶于 70% 二甲基甲酰胺）貯存液，避光保存。
d. 臨用前，制備 BCIP/NET 顯影液：
i. 在 AP 緩沖液中加入 33ulNBT 溶液，混勻。
ii. 加 16.5ulBCIP 貯存液，混勻，避光保存，1h 內使用。
e. 用紙巾將濾膜吸干。
f. 將濾膜沒入 BCIP/NBT 顯影液（每張 82 mm 濾膜用 7.5 ml, 每張 138 mm 濾膜用 15 ml) 室溫持續溫育數小時。
g. 蒸餾水略洗兩遍，在抗原抗體復合物處呈現深紫色。
繼續步驟 16。
利用 4-氯-1 萘酚對抗原-抗體-抗抗體-HRP 復合物進行定位
a. 將濾膜放入含 HRP-偶聯抗體的溶液中，于室溫下輕輕搖動 1.5~2 h。
b. 按步驟 14 洗滌濾膜。
c. 將 60 mg4-氯-1 萘酚溶于 20 ml 冰預冷的甲醇制成顯影液。使用前，和 100m[含 60ul 30% H2O2 的 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、150 mmol/LNaCl 溶液混合。
d. 用紙巾將濾膜上的水吸干，再用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.5)、150 mmol/LNaCl 溶液略洗一下。
e. 將濾膜浸入到 4-氯-1 萘酚顯影液中（每張 82 mm 濾膜需 10 ml, 每張 138 mm 濾膜需 25 ml) 室溫溫育 15~20 min。
f. 蒸餾水洗滌兩遍，在抗原-抗體復合物處顯現深紫色。
生物素化的種特異性抗體及抗生物素蛋白質偶聯的 HRP 也已商品化，應按不同廠商的使用說明書進行稀釋，如上述 HRP-偶聯抗體一樣進行免疫篩選。
生色反應篩選后，λ噬菌體克隆可在印染的濾膜上直接挑取（Alter and Patriel990), 用解剖刀片刮濾膜的方法所獲得的感染顆粒數量很不一致，每個印染印記可從 100 到 104pfu, 刮下來的印記可與 20ulSM 混合，4°C 過夜，在合適的 E.coli 菌株中按一定稀釋梯度重新鋪板。當然利用印染濾膜與原始噬菌斑對齊的傳統方法可得到更多數量的噬菌體。然而，數量過大并非好處，因為下一步將進行重組噬菌體的噬菌斑純化。
若使用刀刮的方法，建議再用傳統的方法對濾膜和噬菌斑進行印證，尤其是篩選大的 cDNA 文庫時，可做到萬無一失。
化學發光篩選
化學發光反應是檢測免疫陽性噬菌斑最靈敏的方法。第二抗體一般與 AP 或 HRP 偶聯，使用 AP-偶聯的抗體時需要如 1,2-dioxetane phosphates 這樣的底物。這種底物被磷酸化后可在 466nm 波長處發光，HRP-偶聯的抗體可氧化底物魯米諾，后者在過氧化氫和苯酚存在下，可于 428nm 波長處發出強光。在兩種系統中，發出的光可用放射自顯影來捕獲。化學發光檢測快速、靈敏（1~10pg 的抗原可被檢出），且可得到永久性的篩選濾膜記錄（X 射線膠片)。兩項潛在的缺點是試劑的高成本以及需要對放射自顯影片與母板進行比較才能得到陽性克隆，下面是典型方案。
a. 將濾膜放入含 AP 或 HRP 偶聯抗體的溶液中，于室溫下輕緩搖動 1.5~2 h。
b. 按步驟 14 對濾膜進行洗滌。
c. 按廠家說明書制備化學發光反應底物。
d. 將洗過的濾膜與化學發光反應底物溫育 1~5 min(按照廠家建議，確定最佳曝光時間）。
e. 將濾膜上多余液體除去，立即包在 Saran 包裝膜中，不要使濾膜干涸。
f. 放射自顯影（請見附錄 9)。一般初次曝光 1 min, 然后根據此間隔來決定合適曝光時間。
繼續步驟 16。
16. 對陽性斑進行定位，或與復印濾膜比較，以確定相吻合的信號。若用放射標記或化學發光探針篩選，則在光箱表面將放射自顯影結果與瓊脂平板比較，若用生色反應試劑篩選，在濾膜上可留下一可見的陽性殘跡，繼續下列步驟：
a. 濾膜上鋪蓋一張 Saran 或 Mylar 包裝膜。
b. 在 Saran 包裝膜的表面用不同顏色的防水記號筆標記濾膜上孔的位置，以及抗原陽性克隆的位置，Saran 包裝膜上還應作好標記，以便找到與濾膜相對應的平板。
c. 把 Saran 包裝膜放在讀片光箱表面，將含有原始入噬菌體噬菌斑的平板放在膜上核對。
d. 確定陽性噬菌斑區，用巴斯德吸管的寬口吸起這一區域的瓊脂塊，放到加有 2 滴氯仿的 1 mlSM 中。
e. 保存 Saran 包裝膜作為陽性噬菌斑定位的永久記錄，至于原濾膜上的有色斑點很快就會消退。
17. 于 4°C 放置若干小時后，使噬菌體從瓊脂塊中洗脫出來。確定洗脫液中噬菌體的滴度，重新按大約每個 90 mm 平皿 3000 個噬菌斑的密度鋪板培養。按上述方法從步驟 4往后再次篩選噬菌斑，反復篩選和鋪板。直至得到一致的免疫陽性重組噬菌體。
|
|---|
