篩選解離速率優化的scFv

選擇3~5輪后，隨機挑取克隆加入96孔微量滴定板中 并誘導表達可溶性scFv.然后，在包被有相關抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細菌上清。此過程可以識別出那些結合了抗原的scFv.但即便采用上述嚴謹性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號強度不能很好地顯示哪個克隆具有較低的Ka值，而且更為普  遍的是它與scFv表達水平相關。

因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術，能識別出具有較低Ka值的克隆。競爭性或抑制性ELISA就是這樣的技術。或者可以利用以下事實：koff降低一般是導致高親和力提高的主要動力學機制，因此通過測定解離速率就可以識別出那些親和力得到提高的抗體。

因為κoff是非濃度依賴的（不同于kon,），所以無需純化抗體片段就能測定κoff，比如采用類似BIAcore的儀器進行SRP分析。我們已發現這是鑒別高親和力scPv的一項很有用的技術，還可以以此來評分親和力成熟了的克隆的等級。

首先，我們用ELISA識別出結合性克隆。然后，隨機挑取20一50個選擇的ELISA陽性克隆；根據κoff大小排隊比較。再選出那些κoff最低的克隆進行亞克隆、純化，并用BIAcore進行SRP測定其Kd值。需要注意的是，在scFv情況下，解離曲線形狀可以指示出是否存在單個或多個κoff值。

有多個κoff值的scFv（當以R1/R0對于作圖時，出現一條曲線對一條直線）是單體和二聚體的混合物，最好避免用于續后的研究。

用Biacore儀篩選解離速率較低的scFv

[器材和試劑]

●  Biacore SPR儀（Biaeore lnc.）

●  CM5傳感芯片（Biacorelnc.）

●  Biacore EDC/NHS固化試劑盒（Biacore lnc.）

●  10retool/L乙酸鈉，pH 4.5

●  N-（2-羥乙基）哌嗪-N,-（2-乙烷磺酸）  Hepes緩沖鹽水（10mmol/L Hepes、150mmol/L  NaCl、3.4mmol/L  ED TA）（HBS）

●  2XTY/amp/glu

●  含100ug/m1氨芐青霉素和0.1%葡萄糖的2XTY培養基（2X TY/amp/0.1%glu）

●  lmol/L異丙基于D-硫代半乳糖苷（IPTG）

●  外周質溶解緩沖液（PPB）（20%蔗糖、 lmmol/L EDTA、20mmol/L Tris- HCl,Ph8） 5retool/L MgS04

●  Centrisep柱（Princeton Separations）

[方法]

1. 每個克隆用1ml 2×TY/Amp/S1u 30℃培養過夜，250r/min振蕩。

2. 取50u1過夜培養物，加入到含有5ml 2XTY/amp/0.1%glu的50ml試管內；并在30℃培養大約2小時，250r/Illin振蕩，吸光度（A600）大約0.9.

3. 每管加入2.5ul lmol/LIPTG誘導scFv表達（終濃度為500umol/L），并在30℃培養4h,250r/min振蕩。在1個15ml Falcon試管內4000g離心15分鐘，收集細胞。

4. 準備外周質提取物。用200u1 PPB緩沖液重懸細菌沉淀，將沉淀懸液轉移到1.5m1試管內，放于冰上20分鐘；這會使細胞皺縮并提取部分scFv蛋白；加入低滲性MgCl2使外周質處于高滲狀態促進腫脹。用微型離心機沉淀細胞，6000r/min 5分鐘。棄去上清。細菌沉淀部分將用于滲透壓休克的制備。

5. 準備滲透壓休克組分。用200u1 5mm01/L MgSO4重懸沉淀并在冰上孵育重懸沉淀物20分鐘。用微型離心機全速（14000r/min）離Jc沉淀細胞5分鐘。取1支新試管保存上清，即為滲透壓休克組分。

6. 用CentriSep柱將含有scFv的滲透壓休克緩沖液換為Blacore運行緩沖液（HBS），操作按廠家所述進行。

7. 根據廠家說明書裝配Biacore儀。在Biacore儀流動池內，用EDC/NHS化學法將靶抗原固化在CM5傳感芯片上，操作按廠家所述進行。

8. 將步驟5所制備的scFv樣品注入到流動池內，1分鐘。而后，保持15u1/min的恒定流速，用HBS作為運行緩沖液，觀察解離相2一10分鐘。

9. 再生芯片的表面，并進行下一個scFv分析。可以編寫程序使此過程自動進行，使40~50個scFv的數值能自動進行過夜分析。使用Biacore廠家提供的軟件，可對每個所分析的scFv自其感應圖的解離部分測定出表觀κoff值。

經過上述分析后，就能根據Aof/值高低將克隆依次排列。然后，純化解離速率最低的scFv并測定其Kd值。這種載體附加了C末端六組氨酸標簽，因此，用固相金屬親和層析（IMAc）從外周質中純化出scFv.而這對于那些在已含有六組氨酸標簽的噬菌體展示載體中的克隆來說，卻無必要。

而后，用膠過濾方法去除凝集的和二聚化的scFv,用BIAcore儀進行SPR測定κon值和Aoff值，再以此計算出Kd值。