簡并寡核苷酸誘變實驗

大腸桿菌

DNA聚合酶dNTP甘油NaClEDTASDS無水乙醇

水浴鍋離心機分光光度計

1.  設計寡核苷酸，其3‘端含有由8個核苷酸組成的回文結構，且包含某一限制性內切酶的識別位點；如果可能的話，5’端也應有一含某個限制性內切酶位點的序列。中間區段則應含目的誘變區。
 

圖一、簡并寡核苷酸的設計

2.  寡核苷酸的合成。在無需突變的位置時，用一種核苷酸前體的同質溶液進行合成，而在需要突變的位置時，則用特定的核苷酸前體混合物來控制合成反應的進行。

3.  通過HPLC和（或）含7 mol/l 尿素的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化每核苷酸，用水調整濃度至1 mg/ml。

4.  取200 pmol （1~2 μg）寡核苷酸加至一個500 μl 的微量離心管中，加水至7 μl 溫育5 min。

5.  加1 μl 10×DNA聚合酶1緩沖液，降溫至適合3‘端回文結構雜交的溫度，保溫不少于60 min。

6.  加2 μl 2.5 mmol/l 4種dNTP混合液，5 U klenow酶，再加10 μCi的任意一種［α-³²P］，23℃保溫1 h。另加入5 U的klenow酶繼續溫育2 h或過夜。

7.  加1 μl 0.5 mol/l EDTA終止反應，加TE緩沖液至總體積為50 μl，加乙酸鈉至終濃度為0.3 mol/l。用緩沖液平衡酚抽提，無水乙醇沉淀DNA。DNA重懸于20 μl TE緩沖液。取出2 μl 留待作變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析之用。
 

8.  在30 μl 反應體積內，每微克塞核苷聯用10~40 U 的識別外側限制性酶切位點的酶消化雙鏈寡核苷酸2 h 以上，如寡核苷酸5’端無限制性內切酶位點，則用識別內側限制性內切酶位點的酶切割。

9.  取出2 μl 留待作變性聚丙烯酰胺凝膠電泳之用，余下的用緩沖液平衡酚抽提，無水乙醇沉淀，在重懸于不少于10 μl 的TE緩沖液，然后用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化。

10.  切下雙鏈DNA所在的膠，并用凝膠洗脫緩沖液將其洗脫出來，用20 μl 的TE緩沖液重懸，貯存于-20℃。

11.  用識別內側酶切位點（位于原來的寡核苷酸的3’端）的限制性內切酶消化雙鏈寡核苷酸，以生成一同源雙鏈寡核苷酸混合物，其5’和3’端適于將它們連接進常規的的載體中去。取留待作變性聚丙烯酰胺凝膠電泳之用，剩余的用酚抽提， 乙醇沉淀，重懸于20 μl  緩沖液。

12.  步驟7、9、11中留取的2 μl 液體用變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，以證實各步反應均產生了所要的產物。

13.  按系列稀釋法用TE緩沖液從10到10 000倍系列稀釋雙鏈寡核苷酜，設置一系列的連接反應，每個反應均含有恒量的載體和部分上述稀釋液。

14.  用常規的轉化方法將連接反應物轉化進適當的大腸桿菌。通過限制性內切酶酶切和DNA序列測定來分析所得的DNA。