簡并引物設計的新手入門

最近想用“簡并引物”設計點實驗做做，上網找了點東東，還是發現了不少東西。特總結如下：主要包括簡并引物設計 常用的幾個方面及簡并因為設計時的注意事項。

簡并引物是指代表編碼單個氨基酸所有不同堿基可能性的不同序列的混合物。密碼子具有簡并性，單以氨基酸順序推測編碼的DNA序列是不精確的，但可以設計成對簡并引物，擴增所有編碼已知順序的核酸序列。用簡并引物時寡核苷酸 中核苷酸序列可以改變，但核苷酸的數量應相同。

簡并度越低，產物特異性越強，設計引物時應盡量選擇簡并性小的氨基酸，并避免引物3’末端簡并，針對簡并的混合引物已成功地用于未知靶DNA的擴增、克隆 和序列分析。

為了增加特異性，可以參考密碼子使用表，根據不同生物的堿基使用偏好，減少簡并性。次黃嘌呤可以同所有的堿基配對，降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡并堿基，因為3'端最后3個堿基的退火足以在錯誤位點起始PCR。使用較高的引物濃度(1μM到3μM)，因為許多簡并混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

同時，簡并引物應選用簡并程度低的密碼子, 例如選用只有一種密碼子的Met, 3'端應不存在簡并性。否則可能由于產量低而看不見擴增產物.現已成功地克隆了豬尿酸氧化酶基因、糖尿病相關肽基因和哺乳動物與禽類的嗜肝病毒基因。用脫氧肌苷(deoxyinosine;DI)引物進行PCR ，可以代替編碼蛋白的多種簡并密碼子中的簡并堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度影響。

簡并引物的設計：

簡并引物是根據某些特定的目的而選用的一組混合物，指在寡核甘酸的某一位置(一個簡并位)上有多個堿基存在于不同的寡核甘酸分子中，如一組簡并引物中有N1，N2，N3三個簡并位，在N1上有三個堿基簡并，N2二個，N3 四個，則此簡并引物中共有3*2*4=24種寡核甘酸分子。

簡并引物常用的幾個方面：

1.從已知蛋白到相關核酸分子的研究。

2.用一組引物擴增一類分子。

在上述兩個主要應用中，需要注意的幾個主要問題:

1. 從蛋白到核酸，應注意：

① ，盡量選擇簡并度低的氨基酸區域為引物設計區。如蛋氨酸和色氨酸均只有一個密碼子。

② ，充分注意物種對于密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。

③ ，引物不要終止于簡并堿基，對于大多數氨基酸殘基來說，意味著引物3’末端不要位于密碼子的第三位。

④ ，在簡并度高的位置，可用次黃嘌呤(dI)代替簡并堿基。

以上幾點，遵循的總的原則為：盡量降低引物的簡并度，尤其在3’末端或近3’末端。

2.用一對簡并引物擴增一類DNA分子時，同樣遵循上述總的原則，即盡量降低引物的簡并度，尤其在3’末端或近3’末端。

在此種應用中，應先利用工具軟件(多序列對準比較軟件)或其它工具找到這些分子的保守區，然后根據共有序列，應用上面所述的一些原則來設計所需要的引物。