β-半乳糖苷酶除了能夠催化β-半乳糖苷化合物中的β-半乳糖苷鍵發生水解，還具有轉半乳糖基的作用。早期的研究表明，β-半乳糖苷酶上的活性位點有兩個功能團：Cys 的巰基和His 的咪唑基，它們對β-半乳糖苷酶水解乳糖起重要作用。據推測，硫基可作為廣義酸使半乳糖苷的氧原子質子化，而咪唑基可作為親核試劑進攻半乳糖分子第1個碳原子上的親核中心，形成1 個含碳氫鍵的共價中間物。在被切割下咪唑基之后，巰基陰離子從水分子中抽取1個質子，從而形成-OH 進攻C。有研究認為乳糖酶的催化機制與溶菌酶類似。當半乳糖苷的受體是水時，發生的是水解；當受體是另外的糖或醇時，則發生轉半乳糖苷作用；如受體是乳糖，則可以生成三糖的低聚半乳糖。