比伐蘆定是凝血酶的直接抑制劑，與游離及血栓上凝血酶的催化位點和陰離子外結合位點特異結合起抑制作用。比伐蘆定與凝血酶的結合過程是可逆的，凝血酶通過緩慢的酶解比伐蘆定Arg3-Pro4之間的肽鍵可使凝血酶恢復原來的生物活性。
體外研究表明，比伐蘆定不僅能抑側游離的凝血酶，還能抑制與血塊結合的凝血酶而不會被血小板釋放出的物質中和，它能延長正常人血漿激活的部分促凝血酶原時間(APTT)、凝血酶時間(TT)、凝血酶原時間(PT) 和活化凝血時間（ACT）延長，并與比伐蘆定的濃度呈線性關系，但臨床應用是否存在這種相關性尚不清楚。