算法輔助的超多重PCR引物設計實現超低的引物二聚體水平

近日，專注于核酸分子雜交底層技術研發和應用轉化的創新型分子診斷公司閱爾基因與同濟大學附屬上海肺科醫院任勝祥教授合作在Nature Communications再次發表重磅研究，介紹了一種多重PCR引物設計的核心算法SADDLE，在大型擴增子法測序panel中首次實現了超低的引物二聚體水平。SADDLE在提高中靶率的同時也降低了測序成本，進一步擴展了相關技術在臨床實踐中的應用范圍。

高通量測序（NGS）在遺傳疾病、腫瘤驅動基因、宏基因組測序以及鑒定病原微生物等多個領域可以幫助研究者高效地獲得基因組信息。當關注的基因數目不是很多或者目標區域占基因組的比例不高時，全基因組測序并不是最優選擇，使用靶向捕獲或者多重PCR建庫將是更好的選擇。多重PCR方法操作步驟相對簡單，對樣本的需求量較低，在生命科學研究和臨床應用中均具有廣泛應用。此外，多重PCR還可以實現相比連接酶方法更高的測序接頭（Adapter）連接效率，針對cfDNA、穿刺樣本、胚胎植入前檢測（PGT）樣本等DNA含量有限的情況尤其適用，相關細節在閱爾基因近日發表的另一篇文章（Ensemble of nucleic acid absolute quantitation modules for copy number variation detection and RNA profiling）中進行過論述。然而，擴增子測序常常難以應用到覆蓋上百基因的大型panel當中，其中很重要的原因在于非線性增長的引物二聚體會降低NGS數據的mapping率，進而增加實際的檢測成本。針對這一問題，主流的做法有：1.通過在引物中添加經修飾的堿基以便酶解去除；2.根據片段大小進行篩選去除。顯然，這類補救措施都有一定的局限性。相反，從源頭抑制引物二聚體產生的系統性研究工作卻鮮有報道。 

眾所周知，超多重PCR設計相比單重PCR要復雜的多，更多引物對的加入常常導致體系中的引物二聚體呈爆炸式增長，例如，N重的PCR，引物二聚體可以有C（2N，2）種組合；而M個位點引物則可以有M2N種組合，窮舉所有可能性以尋找最優解顯然不現實。在數學上，多重引物設計是一個具有高度非凸適應值曲面（non-convex fitness landscape）的高維問題，標準的凸性優化算法（比如gradient descent）并不適用。因此，從底層角度出發，開發一個節約計算資源的、引物二聚體形成少的多重引物設計算法對于將多重PCR應用的靶向高通量測序，進一步減少基因檢測所需樣本量具有重要意義。

該最新項研究開發了一個全新的設計多重引物的算法——二聚體似然估計的模擬退火設計（SADDLE），可以高效地設計多重PCR的引物，有效地降低引物二聚體形成，大大擴展擴增子測序的應用場景。SADDLE的過程包括以下幾個步驟：

（1）生成引物池：擴增子測序的PCR產物最短不能短于待測位點的序列，最長不能長于NGS測序模式的讀長。3’端位于最短序列之外、5’位于最長序列之內的引物，其擴增產物均可滿足擴增子測序的要求。基于該原則，可獲得一系列長度不等、與模板的結合能量不等的預用引物池。研究者的前期研究證明當引物和模板結合的ΔG°≈?11.5 kcal/mol時可以很好的平衡效率和特異性。此外，引物太短與模板的結合不穩定而導致擴增效率下降；引物太長則更可能與基因組的其它序列匹配而產生非特異擴增。進一步地，從預用引物池里挑選大小合適，ΔG°介于-10.5~-12.5 kcal/mol，并且GC含量介于-0.25~0.75的引物對，生成引物池。

（2）選取初始引物：針對每一個待擴增序列選取一對初始引物。

（3）計算初始引物的損失函數（Loss function，L(S)）：損失函數是計算引物形成引物二聚體的函數，針對選取的引物兩兩之間的損失值(Badness)總和。其計算公式如下：

第一項是引物兩兩之間形成異源引物二聚體的損失值總和，第二項是同一條引物形成同源引物二聚體的損失值總和，該損失值是在設計引物的時候就計算好的。損失值的計算公式如下：

損失值在任意兩條引物之間形成4個或4個以上連續的堿基互補配對的序列，容易形成引物二聚體的情況下進行計算。Len堿基互補配對的堿基數，d1和d2是各自引物的互補配對序列與引物的3’的距離（單位：堿基數），numGC是互補配對序列里的GC堿基數。此處選擇4作為閾值是因為研究團隊在前期研究中表明3個堿基的互補配對并不影響PCR反應。該算法只關注了互補配對序列與3’端的距離，而沒有關注與5’端的距離，是因為PCR反應對3’的匹配要求大于對5’端的匹配要求。計算損失值步驟是SADDLE最消耗資源的步驟。

對于損失值的評估，可以如下理解：兩條引物之間的互補配對的序列數越多，離3’端越近，GC含量越高，這樣的引物對的損失值越高。損失值越高，形成引物二聚體的可能性越大，損失值越低，形成引物二聚體的可能性越小。

（4）生成臨時引物：隨機選取任意一條引物或一對引物。

（5）計算臨時引物的損失函數：用上述公式對臨時引物計算損失函數，并與上一次選取的引物的損失函數進行比較，如果臨時引物的損失函數更小，那么這條/對臨時引物就會迭代上一條/對選取的引物。

（6）重復步驟4,5，直至滿足預設的邊界條件。研究團隊一般推薦多設置幾個初始引物，以確保獲得最佳的引物組合。

圖1.SADDLE算法的基本流程

接下來，研究團隊嘗試將SADDLE應用到一個靶向腫瘤相關基因的96-plex panel中。整個過程在一臺普通PC儀上僅耗時10分鐘左右。作為對比，團隊一共合成了未優化（PS1）、部分優化（PS2）、飽和優化（PS3）三套引物組合進行實驗驗證。

除了NGS之外，該團隊還將SADDLE方法應用到qPCR當中，實現了低成本的融合基因超多重檢測。與此同時，非特異性擴增的問題在低引物二聚體的背景下凸顯出來，該團隊將據此進一步優化算法，挑戰更大型的擴增子測序panel。

原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29500-4

“NGS panel中引物二聚體的形成會降低mapping率，既增加成本也降低了測序靈敏度，”文章第一作者Nina G. Xie表示。“通過算法設計出低引物二聚體的超多重PCR引物組，SADDLE解決了擴增子測序文庫制備方法的關鍵瓶頸之一，并且簡化了靶向測序panel的實驗流程。”靶向測序或者qPCR方法都被廣泛用于檢測疾病相關的DNA突變，前者能提供更豐富的信息，但成本高、周期長，qPCR相比而言更簡便快速，但能提供的DNA標志物信息卻很有限（通常小于6個）。SADDLE的出現可以大大提升這兩個平臺的能力。

“借助SADDLE，我們設計并驗證了一個引物二聚體比例顯著下降的靶向測序panel，” 該研究的共同通訊作者、同濟大學附屬上海肺科醫院任勝祥教授提到。“此外，我們也設計了單管的多重qPCR方案，可以同時檢測56個不同的基因融合，并且通過了臨床樣本驗證。”

“我們認為qPCR和靶向測序panel對于精準醫療是同等重要的工具，” 該研究共同通訊作者、閱爾基因美國創新中心負責人David Zhang表示。“前者提供了一種經濟快速的檢測手段，后者可以給出全面的基因組信息進而輔助治療。閱爾基因致力于相關技術的開發與轉化以推動分子診斷方法的發展，造福人類健康。”