2. 磷酸化樣本的 DDA 鑒定、可信度篩選和譜圖庫建立
磷酸化樣本信息和色譜質譜參數見實驗條件部分。3 針 DDA 數據按磷酸化檢索流程使用 Proteome Discoverer 2.0 軟件搜庫鑒定（S/T/Y+79.966 Da），并使用 ptmRS 模塊對位點打分（圖 2-1）。搜庫完成后，打開結果，使用 Filter 功能對 PSM 列表“Isoform Confidence Probability”項進行篩選，保留得分大于等于 0.75 的 PSM（圖 2-2）。然后，點右鍵選擇”Check All-In This Table”，將符合條件的PSM選定。最后，在”Spectra”中導出mzML格式，在“To PepXML”中導出 PepXML 格式，并將兩個文件置于同一文件夾中，即可作為譜圖庫導入 Skyline（圖 2-3）。
圖 2. 翻譯后修飾 DDA 數據檢索、位點篩選和結果導出步驟
經 phosphoRS/ptmRS 計算得到每個磷酸化位點的打分（Site Probability），分數 > 75（或 0.75）則位點有確切的碎片支持，定位可靠。搜庫引擎沒有針對位點打分的功能，位點定位錯誤概率大。圖 3 是一個典型的例子：RFSVTAEGGLTLEQVTDAR 肽段搜庫鑒定出包含 1 個磷酸化位點的多個 PSM，3 號位絲氨酸和 5 號位蘇氨酸均有匹配到磷酸化發生（FDR < 1%）。而 ptmRS 的打分結果卻分 3 種情況：1) ptmRS 得到唯一可靠的位點，且與搜索引擎得到的位點一致，此時 Isoform 100% 確定（圖 3-A）；2) ptmRS 得到兩個位點都有可能，無法確定唯一位點，此時 Isoform 可靠度為 50%（圖 3-B）；3) ptmRS 得到唯一可靠的位點，但與搜索引擎得到的位點不一致，此時 Isoform 可靠度為 0（圖 3-C）。最終，只篩選 Isoform打分（Isoform Confidence Probability）_ 75（或 0.75），即所有位點均明確、可靠的肽段建立譜圖庫。
圖3. 搜庫引擎/ptmRS結果一致、部分一致、不一致三種情況示例
實驗共鑒定 56617 張 PSM（FDR < 1%），經過 Isoform Confident Probability 篩選，共獲得 30558 張精確定位、isoform 唯一的磷酸化肽 PSM（圖 4），結果導成 mzML 和 PepXML 格式作為譜圖庫。
圖 4. Isoform Confident Probability 篩選前后 PSM 比較
3. 基于精確譜圖庫的磷酸化樣本 DIA 數據解析
將 mzML 和 PepXML 格式文件導入 Skyline 生成磷酸化肽譜圖庫，用于磷酸化肽段 DIA 數據解析。Skyline 將譜圖庫中所有肽段作為 targets 對 DIA 數據中進行提峰，每條肽段選取 3 個母離子（單同位素, 單同位素 +1, 單同位素 +2）和 6 個響應最高的 b/y 離子。提峰結果使用 mProphet 進行假陽性評估，Q 值 < 0.01（即 FDR < 1%）為可信的提峰結果。