N-糖基化是在內質網上由糖基轉移酶催化，在內分泌蛋白和膜結合蛋白的天冬酰氨殘基的氨基上結合寡糖的過程，即在粗面內質網的核糖體上合成蛋白肽鏈的同時，一旦形成天冬氨酸-Xaa-色氨酸-/絲氨酸(Asn-Xaa-Ser/Thr, Xaa為除脯氨酸外的所有氨基酸殘基)三聯序列子密碼,即糖基化位點，才有可能開始糖基化，隨著肽鏈進入內質網腔，N-糖鏈可被位于內質網腔膜結構上的加工酶修剪、加工成高甘露糖型，再進入高爾基體,繼續被膜結構上的酶加工合成。少數情況下，天冬氨酸-Xaa-半光氨酸(Asn-Xaa-Cys)序列也作為糖基化位點。N-糖基化的過程中涉及多種酶的參與，主要是糖酰基轉移酶和糖苷酶兩大類，前者負責將活性供體(通常是NDP-糖)的單糖部分轉移至接納體物質如糖、蛋白質和脂等分子上；后者的催化活性是修剪糖蛋白糖鏈上的各種糖基，二者共同完成N-糖基化。