照紫外可見分光光度法(通則0401)測定。底物溶液冰凍保存,但不得反復凍融。取N-乙酰-L酪氨酸乙酯23.7mg,置100ml量瓶中,加磷酸鹽緩沖液(取0.067mol/L磷酸二氫鉀溶液38.9ml與0.067mol/L磷酸氫鈉溶液61.1ml,混合,pH值為7.0)50ml,溫熱使溶解,冷卻后再稀釋至刻度,搖勻供試品溶液取本品適量,精密稱定,加0.0012mol/L鹽酸溶液溶解并定量稀釋制成每1ml中含12~16糜蛋白酶單位的溶液。測定法取0.0012mol/L鹽酸溶液0.2ml與底物溶液3.0ml,在25℃±0.5℃,于237nm的波長處測定并調節吸光度為0.200。再精密量取供試品溶液0.2ml,加底物溶液3.0ml,立即計時并搖勻,每隔30秒讀取吸光度,共5分鐘(重復一次),吸光度的變化率應恒定,恒定時間不得少于3分鐘若變化率不能保持恒定,可用較低濃度另行測定。
每30秒的吸光度變化率應控制在0.008~0.012,以吸光度為縱坐標,時間為橫坐標,作圖,取在3分鐘內成直線部分的吸光度,按下式計算。A-A0.0075TW 式中P為每1mg廉蛋白酶的效價,單位A2為直線上開始的吸光度;A1為直線上終止的吸光度;
T為A2至A1讀數的時間,分鐘;W為測定液中含供試品的量,mg;0.0075為在上述條件下,吸光度每分鐘改變0.0075,即相當于1個糜蛋白酶單位。