分子的紫外可見吸收光譜是由于分子中的某些基團吸收了紫外可見輻射光后，發生了電子能級躍遷而產生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團的信息。可以用標準光譜圖再結合其它手段進行定性分析。
根據Lambert-Beer定律：A=εbc，（A為吸光度，ε為摩爾吸光系數b為液池厚度，c為溶液濃度）可以對溶液進行定量分析。
你可以用紫外可見分光光度計測定定三種農藥的波長在某溶液中的最大、最小吸收波長。
配制溶液－在光譜檢測項下進行－調整檢測光譜范圍及速度－－掃描光譜圖－－吸光度最大處對應波長為最大吸收波長，吸光度最小處對應的波長為最小吸收波長。
1.光源燈;2.濾光片;3.球面反射鏡;4.入射狹縫;5.保護玻璃;6.平面反射鏡;7.準直鏡;8.光柵;9.保護玻璃;10.出射狹縫; 11.聚光鏡;12.試樣室; 13.光門;14.光電管.
分光光度計工作原理:
由光源燈(1)發出連續輻射光線,經濾光片(2)和球面反射鏡(3)至單色器的入射狹縫(4)聚焦成像,光束通過入射狹縫(4)經平面反射鏡(6)到準直鏡(7)產生平行光,射至光柵(8)上色散后又以準直鏡(7)聚焦在出射狹縫(10)上形成一連續光譜,由出射狹縫選擇射出一定波長的單色光,經聚光鏡(11)聚光后,通過試樣室(12)中的測試溶液部分吸收后,光經光門(13)再照射到光電管(14)上.調整儀器,使透光度為100%,再移動試樣架拉手,使同一單色光通過測試溶液后照射到光電管上.如果被測樣品有光吸收現象,光量減弱放大器處理,將光能的變化程度通過數字顯示器顯示出來.可根據需要直接在數字顯示器上讀取透光度(T),吸光度(A)或濃度(C).
基本操作:
(1)通電---儀器自檢----預熱20min;
(2)用鍵設置測試方式:透射比(T),吸光度(A),已知標樣濃度方式(C)和已知標樣濃度斜率(K)方式;
(3)波長選擇:用波長調節旋鈕設置所需的單色光波長;
(4)放樣順序:打開樣品室蓋,在1~4號放置比色皿槽中,依次放入%T校具(黑體),參比液,樣品液1和樣品液2.
(5)校具(黑體)校"0.000":將%T校具(黑體)置入光路,在T方式下按"%T"鍵,此時儀器自動校正后顯示"0.000"
(6)參比液校"100"%T或"0.000"A:將參比液拉入光路中,按"0A/100%T"鍵調0A/100%T,此時儀器顯示"BLA",表示儀器正在自動校正,校正完畢后顯示"100"%T或"0.000"A后,表示校正完畢,可以進行樣
品測定.
(7)樣品測定:將兩樣品液分別拉入光路中,此時若在"T"方式下則可依次顯示樣品的透射比(透光度)若在"A"方式下,則顯示測得的樣品吸光度.
7200型光柵分光光度計的使用注意事項(1)
(1) 預熱是保證儀器準確穩定的重要步驟.
(2) 比色皿的清潔程度,直接影響實驗結果.因此,特別要將比色皿清洗干凈.先用自來水將用過的比色皿反復沖洗,然后用蒸餾水淋洗,倒立于濾紙片上,待干后再收回比色皿盒中.必要時,還要對比色皿進行更精細的處理,如用濃硝酸或鉻酸洗液浸泡,沖洗.
(3) 比色皿與分光光度計應配套使用,否則會引起較大的實驗誤差. 比色皿不能單個調換 1.3 7200型光柵分光光度計的使用注意事項(2)
(4) 比色皿內盛液應為其容量的2/3,過少會影響實驗結果,過多易在測量過程中外溢,污染儀器. 比色皿中試樣裝入量應為2/3～3/4之間
(5) 拿放比色皿時,應持其"毛面",杜絕接觸光路通過的"光面".如比色皿外表面有液體,應用綢布拭干,以保證光路通過時不受影響.
(6) 若待測液濃度過大,應選用短光徑的比色皿,一般應使吸光度讀數處于0.1～0.8范圍內為宜.由于測定空白,標準和待測溶液時使用同樣光徑的比色皿,故不必考慮因光徑變化而引起的影響.
UV-754型紫外-可見分光光度計正確使用方法
2.1 紫外分光光度計法概述(1)
2.1.1定義 用紫外光源通過分光光度技術對物質進行測定的方法叫作紫外分光光度法.所使用的儀器叫作紫外分光光度計.
2.1.2原理 因為許多化合物的分子結構中存在共軛雙鍵,在200～400nm的紫外光區具有吸收光的特性,所以無需進行顯色反應便能直接測定.
2.1.3應用 常用于對蛋白質和核酸進行定性,定量測定.蛋白質分子中所含酪氨酸,色氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸殘基在波長280nm處具有最大吸收峰.故常用波長280nm處的吸光度測定蛋白質的濃度.
2.1.4特點
(1) 組成核酸的堿基也含有共軛雙鍵,其最大吸收峰的波長在260nm處.但在280nm處也有一定的光吸收,對蛋白質的測定有一定的干擾作用.若分別測定280nm和260nm處的吸光度,可通過經驗公式消除核酸對蛋白質測定的影響.